CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞可行性分析

采用荧光染料CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞(SPC),评价其生物可行性.分离和培养SPC,采用CMDiI进行标记,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测标记效果和传代后的细胞标记率.同时,进行细胞爬片培养后免疫荧光染色,观察标记后细胞表达平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙调节蛋白(Calponin)和增殖细胞核抗原(PCNA)的情况.进行台盼蓝排斥实验、细胞粘附实验、细胞增殖实验和细胞迁移实验,观察标记后的SPC存活率以及粘附、增殖和迁移能力的变化.结果发现,培养4d左右可见SPC开始生长,一周后出现SPC克隆.通过免疫荧光和流式细胞术分析,CM-DiI标记率为96%左右,连续传代2周后标记率仍在40%以上.标记后的细胞可表达α-SMA、Calponin和PCNA.同时发现,标记后的细胞存活率无明显降低,细胞粘附能力、增殖能力和迁移能力无明显改变.本研究证明采用CM-DiI标记SPC操作简便,效果好,不改变细胞表型,不影响细胞的存活率和粘附、增殖及迁移能力,可作为SPC的荧光示踪剂.     

外周血内皮祖细胞在去细胞猪主动脉瓣膜上种植的体外观察

为在体外观察外周血内皮祖细胞种植到去细胞猪主动脉瓣上的生长情况.采用TritonX-100联合胰蛋白酶、核酸酶去除猪主动脉瓣膜细胞.从志愿者外周血中分离培养内皮祖细胞,免疫荧光鉴定细胞后.将从外周血培养的EPC种植到去细胞猪主动脉瓣膜上,用HE、免疫组化染色和免疫荧光染色观察种植效果.结果显示猪主动脉瓣内的细胞去除彻底,但纤维支架保存良好.人外周血培养出的细胞,免疫荧光染色示ac-LDL和UEA-1阳性,提示为内皮祖细胞,种植后行HE染色可见到去细胞猪主动脉瓣膜表面单层内皮细胞生长,并且表达von Willebrand因子和CD31.     

内皮祖细胞

内皮祖细胞参与胚胎期原始血管网的形成.但近年的研究证实,内皮祖细胞参与出生后的内皮修复和血管新生过程,提示内皮祖细胞在血管再生和心血管疾病治疗中具有很好的应用前景.目前,确定内皮祖细胞还没有一个统一的标准,相对认可为内皮祖细胞的是含CD34、CD133、FLK-1等标志的阳性细胞.在正常情况下,外周血中EPC数量很低.本文侧重综述了EPCs的表型、鉴定、分离培养、数量.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

肾上腺素受体对慢性阻塞性肺疾病患者内皮祖细胞修复的作用机制

目的 探讨肾上腺素受体在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血内皮祖细胞中的表达及作用.方法 将110例COPD患者设为COPD组,62例同年龄段健康志愿者为对照组.抽取受试者外周静脉血,密度梯度离心联合免疫磁珠法分离外周血早期内皮祖细胞;RT-PCR和Western blot检测早期内皮祖细胞中 β2肾上腺素受体mRNA和蛋白表达.体外培养早期内皮祖细胞,分别使用β2肾上腺素受体拮抗剂、激动剂以及siRNA下调β2肾上腺素受体表达,通过Transwell小室检测早期内皮祖细胞的迁移能力.结果 COPD组内皮祖细胞中β2肾上腺素受体mRNA和蛋白相对表达量均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).Transwell迁移实验显示:COPD组迁移细胞数明显少于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);随着β2肾上腺素受体拮抗剂浓度的增加,COPD组迁移细胞数逐渐增多;随着去甲肾上腺素浓度的增加,COPD组迁移细胞数逐渐减少.siRNA转染早期内皮祖细胞72 h后,COPD组迁移细胞数明显少于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 β2肾上腺素受体在COPD患者早期内皮祖细胞中存在高表达;下调β2肾上腺素受体表达能够提升COPD患者早期内皮祖细胞的迁移功能,促进受损血管内皮的修复,降低心血管疾病的发生风险.     

小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型,试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。先采用机械分离方法分离子宫平滑肌,再用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法消化,可获得90%以上具有正常代谢活性的小鼠子宫平滑肌细胞,存活的细胞经倒置显微镜观察和免疫荧光染色进行鉴定。原代培养3d后细胞贴壁生长,约2周后细胞汇合成片,所培养的细胞在倒置显微镜下呈梭形和典型"峰-谷"样生长,平滑肌细胞肌动蛋白(α-Actin)免疫荧光染色强阳性。采用本法体外培养的小鼠子宫平滑肌细胞生长良好,纯度高,可用于小鼠子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的研究。     

血管段孵育和原代血管平滑肌细胞培养的比较

探讨微血管段孵育方法能否与原代平滑肌细胞培养一样检测蛋白表达,以用于初步的基础研究,解决原代培养耗时、不易存活的问题。分离大鼠肠系膜动脉三级以下分支,使用胶原酶和木瓜蛋白酶混合消化单个血管平滑肌细胞,获取的平滑肌细胞采用含20%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。培养的平滑肌细胞经特异性的α-actin进行免疫组化鉴定;血管段孵育是在无菌条件下分离大鼠肠系膜动脉三级以下分支,培养基孵育72 h。分别使用不同浓度的尼氟灭酸(niflumic acid,NFA)孵育原代培养的平滑肌细胞和肠系膜三级分支血管段24 h,观察平滑肌细胞连接蛋白43(connexin43,Cx43)的变化。形态学和免疫组织化学鉴定表明,培养的原代细胞为血管平滑肌细胞。不同浓度NFA处理原代平滑肌细胞能够使Cx43表达量呈浓度依赖性下降,相对于对照组具有统计学意义(P0.01);不同浓度NFA处理血管段能够使Cx43的表达量也呈浓度依赖性下降,相对于对照组具有统计学意义(P0.01)。由此可知,观察平滑肌细胞特异性蛋白Cx43的表达情况,使用血管段孵育的方法检测结果与细胞培养的结果相似。血管段孵育简单易行,可以作为类似实验的初步研究。     

ERK信号转导通路在PDGF诱导的人动脉平滑肌细胞增殖中的作用

了解ERK信号转导通路在PDGF诱导的人动脉平滑肌细胞增殖中的作用.原代培养人脐动脉平滑肌细胞（hUASMC）,取生长正常的细胞分4组：对照组,PDGF（platelet derived growth factor）组,ERK阻断剂组和PDGF＋ERK阻断剂组.继续培养24h后,用免疫细胞化学技术测细胞核内核增殖抗原（PCNA）的表达;用MTT法测细胞的增殖活性.结果显示：1）与对照组相比,PDGF组细胞内PCNA 的表达明显增强,MTT法测得A值也升高（P〈0.01）.2）ERK阻断剂可完全抑制PDGF诱导的PCNA 的表达增多和A值的升高.结论：ERK信号转导通路参与了PDGF诱导的人动脉平滑肌细胞的增殖.     

食管癌Eca109单克隆细胞株的干细胞特性研究

为分离及鉴定食管癌Eca109肿瘤干细胞。将购买上海生命科学研究院的食管癌Eca109细胞株采用有限稀释法进行单克隆培养并进行HE染色;应用免疫细胞化学技术检测Eca109单克隆细胞株中P75NTR、Oct-4的表达;MTT法和平板克隆实验检测细胞体外增殖情况。Transwell小室法检测各细胞株侵袭能力。结果显示,HE染色示细胞形态有圆形、核大和短梭形、核小两种;在Eca109单克隆的细胞中P75NTR强表达、Oct-4表达相对较弱,且在圆细胞株中表达定位于胞核;MTT法测增殖示圆细胞株增殖率明显高于其他细胞株,差异有统计学意义(P<0.001);平板克隆实验示圆细胞株形成克隆团数高于其他细胞株且细胞团大;Transwell法结果示各细胞株侵袭能力相当。由此可知,Eca109细胞中P75NTR、Oct-4核表达阳性的圆细胞有可能为食管癌干细胞。     

冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞膜电位对冠状动脉血管紧张性的影响

冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞的膜电位对冠状动脉血管紧张性的调节具有极其重要的意义.平滑肌细胞和(或)内皮细胞的超极化可导致冠状动脉舒张,平滑肌细胞和(或)内皮细胞的去极化可导致冠状动脉收缩.各种不同因素刺激平滑肌细胞和(或)内皮细胞可使它们产生超极化或去极化的反应从而导致冠状动脉血管舒张或收缩.掌握这一机制可以在临床治疗当中很好的控制患者的冠状动脉血流.     

兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性实验研究

探索血管平滑肌细胞和新型可降解材料聚羟基西酯（PHB）的细胞相容性,为组织人工血管的构建寻找理想的支架材料。将组织法体外培养的兔血管平滑肌细胞种植在PHB膜片和PHB三维微孔支架上,在相差显微镜下观察细胞的粘附和生长情况,用MTT法测定细胞粘附率和细胞增殖指数,复合培养7d后进行扫描电镜观察并用流式细胞仪（FCM）测定细胞周期、DNA指数。结果兔血管平滑肌细胞在PHB膜片上粘附率为77％,细胞增殖符合细胞的生长曲线,在PHB三维微孔支架上生长情况良好,并被证实为二倍体细胞。结论是兔血管平滑肌细胞和聚羟基西酯（PHB）的细胞相容性较好,但细胞与材料间的粘附有待进一步改善。     

紫堇总生物碱对血压和离体主动脉平滑肌张力的影响

紫堇总生物碱经耳脉静脉注射家兔,观察血压变化;制备离体主动脉平滑肌条,将其固定于灌流肌槽中记录离体主动脉平滑肌条张力变化.观察了紫堇总生物碱对家兔动脉血压的影响以及对去甲肾上腺素(NA)诱发的离体主动脉肌条的收缩的影响.结果表明,静脉注射紫堇总生物碱可引起动脉血压降低(P<0 05);单独加入紫堇总生物碱未观察到离体血管紧张性的改变,但在NA作用的基础上加入紫堇总生物碱后,引起离体血管收缩效应减弱(P<0 05).因此,紫堇总生物碱具有降低血压和抑制NA引起的血管的收缩效应.     

微囊化基质细胞对脐带血造血干/祖细胞扩增支持

将脐带血单个核细胞与包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠在3种不同的培养液中进行了7d的体外静态共培养.每24h进行总有核细胞计数,在0、72和168h进行流式CD34+细胞分析以及甲基纤维素集落检验.实验结果表明:经过7d的静态共培养,在添加常规剂量造血生长因子的培养液中,总有核细胞扩增了(15±2.85)倍,CD34+细胞扩增了(5.33±0.32)倍,CFU-Cs扩增了(5.6±1.21)倍.微胶囊可以作为一种新的共培养隔离手段,微囊化兔骨髓间充质干细胞在添加适量血清或者造血生长因子组合的条件下对于脐带血造血干/祖细胞在静态下的扩增有明显的促进作用.     

芦丁镉对兔子血压和离体主动脉平滑肌的影响

芦丁镉金属配合物经耳脉静脉注射家兔,观察其血压变化;制备离体主动脉平滑肌条,将其固定在灌流肌槽中,记录离体主动脉平滑肌条张力的变化。观察芦丁镉对家兔动脉血压的影响以及对去甲肾上腺素(NA)诱发的离体主动脉肌条收缩的影响。结果表明,静脉注射芦丁镉可引起动脉血压的降低(P<0.05);而在灌流槽中单独加入芦丁镉时不能观察到离体血管紧张性的改变,但是在NA作用的基础上再加入芦丁镉后,便可使离体血管收缩效应减弱(P<0.05)。因此,芦丁合镉金属配合物具有降低血压和抑制NA引起的血管的收缩效应。     

中华宽体金线蛭神经元与神经节内平滑肌细胞间突触的超微结构

用胞内注射辣根过氧化物酶(HRP)的方法标记中华宽体金线蛭AP神经元。透射电镜下观察到神经节的内、外囊中的平滑肌细胞膜间、以及标记AP神经元的轴突末梢膜与神经节中平滑肌细胞间的连接。通常,单个的平滑肌细胞散布在神经节的内、外囊中,分别为椭圆形和梭形。平滑肌细胞含粗、细两种肌丝,有密斑,具有许多突起。神经节外囊中平滑肌细胞的细胞质中央区有许多糖元颗粒和一些线粒体及粗面内质网;两个嵌合的平滑肌细胞膜间距为13.1～26.1nm。首次观察到神经元的轴突末梢与外囊内的平滑肌细胞形成化学突触,突触裂隙10.2～15.3nm;AP标记末梢膜与外囊平滑肌细胞膜之间的间距为2.0～2.5nm,相当于缝隙连接的并置膜结构。     

Differentiation of a bipotential glial progenitor cell in a single cell microculture

Although it is known that most cells of the vertebrate central nervous system (CNS) are derived from the neuroepithelial cells of the neural tube, the factors determining whether an individual neuroepithelial cell develops into a particular type of neurone or glial cell remain unknown. A promising model for studying this problem is the bipotential glial progenitor cell in the developing rat optic nerve; this cell differentiates into a particular type of astrocyte (a type-2 astrocyte) if cultured in 10% fetal calf serum (FCS) and into an oligodendrocyte if cultured in serum-free medium. As the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (0-2A) progenitor cell can differentiate along either glial pathway in neurone-free cultures, living axons clearly are not required for its differentiation, at least in vitro. However, the studies on 0-2A progenitor cells were carried out in bulk cultures of optic nerve, and so it was possible that other cell-cell interactions were required for differentiation in culture. We show here that 0-2A progenitor cells can differentiate into type-2 astrocytes or oligodendrocytes when grown as isolated cells in microculture, indicating that differentiation along either glial pathway in vitro does not require signals from other CNS cells, apart from the signals provided by components of the culture medium. We also show that single 0-2A progenitor cells can differentiate along either pathway without dividing, supporting our previous studies using 3H-thymidine and suggesting that DNA replication is not required for these cells to choose between the two differentiation programmes.     

左旋精氨酸对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖和血管内皮生长因子表达的的影响

观察左旋精氨酸(L-Arg)对大鼠主动脉平滑肌细胞一氧化氮(NO)含量,细胞增殖以及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其发生机制。原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞分为2组,对照组和L-Arg组。各组培养24 h后检测NO、XTT、VEGFmRNA。L-Arg组NO释放量,VEGF表达量远远高于对照组(P<0.01),但XTT显示细胞增殖活性明显下降(P<0.01)。L-Arg可有效抑制血管平滑肌细胞的增殖、增加NO、VEGF的表达,其机制可能与NO的作用,以及NO与VEGF之间的相互调控有关。     

西洋参叶二醇组皂苷抑制血管平滑肌细胞增殖及影响原癌基因表达的研究

观察PQDS对VSMC增殖及原癌基因c-myc的mRNA表达的影响,探讨PQDS抑制VSMC的增殖作用及相关机制。方法用组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMC作为研究对象,用AngⅡ诱导VSMC增殖,随机分为：空白对照组、AngⅡ模型组、AngⅡ＋PQDS 25、50、100mg/L不同剂量组。用MTT法、流式细胞术、RT-PCR法观察PQDS对细胞增殖、细胞周期、增殖指数及原癌基因c-myc的mRNA表达的影响。结果PQDS可减低VSMC的增殖能力,将增殖的VSMC抑制在G0/G1期,可以下调VSMC中的原癌基因c-myc的mRNA表达。结论PQDS能抑制VSMC增殖,其机制可能与下调原癌基因c-myc的表达有关。