包囊游仆虫包囊形成和解脱过程中微管蛋白基因表达的变化

采用干涉相差显微术和实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术显示,腹毛类纤毛虫包囊游仆虫(Euplotes encysticus)包囊形成和解脱过程中,细胞微管胞器始终处于非装配及装配的功能活动状态,脱包囊过程中伸缩泡的运动对细胞充分吸水用于微管胞器的再装配及细胞运动起了关键的作用,细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量相伴发生变化.其中,微管胞器去分化时,细胞形成毛基体非吸收型包囊,细胞α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量整体呈现逐渐减少的趋势,其细胞微管蛋白基因的相对表达量从大到小依次是β-、α-和γ-微管蛋白基因,但α-、β-微管蛋白基因的起始拷贝数远大于后一种微管蛋白基因的表达量;微管胞器再分化时,伴随着伸缩泡的剧烈伸缩运动,口纤毛器和体纤毛器微管先后形成,细胞在包囊内做旋转运动并脱囊而出,迅速转化为营养细胞,期间细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量呈现从小到大增加的趋势,其微管蛋白基因的相对表达量从大到小依次是β-、α-和γ-微管蛋白基因,而前两种微管蛋白基因的起始拷贝数远大于后一种微管蛋白基因的表达量.结果表明,包囊游仆虫形成包囊和脱包囊过程中,伴随着皮层微管胞器的不同分化,细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因始终处于不同的功能活动状态,其中作为微管组织中心主要组分的γ-微管蛋白也始终处于不同的功能状态.     

小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)皮层微管胞器的荧光标记

应用荧光紫杉醇直接荧光标记和抗a-微管蛋白抗体免疫荧光标记,显示了纤毛虫小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)皮层纤毛器微管、纤毛器基部附属微管和背皮层表面微管等结构,以及皮层纤毛器微管的形态发生.结果表明,该游仆虫背皮层表面网在形态上与嗜银网相一致,也是一种微管类细胞骨架;与其他几种游仆虫比较,前仔虫口纤毛器和背皮层纤毛器微管的形态发生存在不同的模式,其形态发生可能具有种的特异性,可以作为种的分类依据之一.此外,与FLUTAX(fluorescence taxoid)标记方法相比较,抗α-微管蛋白抗体免疫荧光标记能较清晰地显示游仆虫背皮层表面微管网及早期发生的额腹横棘毛原基和背触毛原基,推测该游仆虫的细胞背表面微管网与其他微管结构其微管蛋白组分可能存在差异,且形态发生中伴随着皮层纤毛器微管的组装和成熟,其微管蛋白组分同时也在不断发生变化.     

伍氏游仆虫皮层微管类细胞骨架的荧光标记

Flutax直接荧光标记和抗α微管蛋白间接免疫荧光标记显示:伍氏游仆虫皮层细胞骨架是以微管为主要成分组成的各纤毛器骨架和骨架附属微管,以及与非纤毛器骨架相互联系形成的立体骨架.整个皮层骨架包括口围带、波动膜、额腹横棘毛、尾棘毛和背纤毛等纤毛器及其骨架、纤毛器基部附属微管和其他皮层微管骨架.伍氏游仆虫细胞背、腹面存在网格结构;细胞背面存在成列的空洞样结构;毛基体周围的玫瑰花样强荧光标记,呈现更加精细的网格结构.结果揭示:与其他腹毛类纤毛虫相比,游仆虫纤毛器有了明显的功能上的"分工";细胞背腹面存在的网格是游仆虫细胞表面的真实结构,是游仆虫细胞皮层微管类细胞骨架的一部分;细胞背面的空洞样结构及毛基体周围的更精细结构,揭示出毛基体基部存在着更加复杂的微管骨架.所得结果有利于进一步揭示微管类胞器的功能.     

华美游仆虫皮层细胞骨架的超微结构及免疫电镜观察

 应用透射和免疫电镜术,在超微结构水平观察显示,腹毛类纤毛虫华美游仆虫的皮层纤毛器和非纤毛器细胞骨架中,表膜下、细胞质深部的微管或纤维束,以及纤毛器及纤毛器附属微管等均是以α-和 β-微管蛋白为主要成分的微管类结构;中心蛋白定位于纤毛器的基体腔、基体基部近中心端、基体基部近中心端连接及基体中部连接结构中,而在纤毛杆和皮层非纤毛器微管中无中心蛋白成分存在。据此认为,该纤毛虫中,基体部位的蛋白组成机制与纤毛杆及纤毛器附属结构是不同的,非分裂期细胞中定位于基体主体部位的中心蛋白可能与维持相关结构的稳定性有关。     

纤毛虫阔口游仆虫(Euplotes eurystomus)微管类细胞骨架的超微结构

采用透射电镜术显示腹毛类纤毛虫阔口游仆虫(Euplotes eurystomus)的微管类细胞骨架包括纤毛器微管骨架和非纤毛器微管骨架.结果表明:细胞皮层纤毛器中除纤毛杆、纤毛基体微管外,其基体间连接纤维、基体托架、基体附属微管、纤毛器基部附属微管束以及围棘纤维篮等也是皮层纤毛器微管的重要组成部分,各种微管相互联系、聚...     

中心蛋白3定位于游仆虫细胞中形成棘毛的基体上

中心蛋白与中心体(或基体)有着密切关系,作为一种细胞骨架蛋白,形成原生动物巨大的细胞骨架网络;为了研究从八肋游仆虫细胞中克隆到的一种中心蛋白基因(EoCen3)的功能,我们构建了八肋游仆虫细胞大核人工染色体pBTub-Tel,定位分析该基因所表达的中心蛋白在细胞中的分布和行为.该人工染色体利用密码子优化的增强型绿色荧光蛋白基因作为标记,在八肋游仆虫细胞中实现高表达,避免用抗生素作为标记对该细胞的喂养产生影响.定位结果显示,该类中心蛋白特异定位于游仆虫形态发生过程中的基体上.在八肋游仆虫无性生殖细胞分裂的起始阶段基体开始发育,首先形成第一个基体,Eo-Cen3定位于新形成的基体中;随后基体开始复制,EoCen3定位于正在复制的基体中.在细胞发育过程中绿色荧光标记的基体成倍增加,说明EoCen3与参与棘毛形成的基体的复制有一定的关系.     

纤毛虫阔口游仆虫皮层微管胞器的形态及形态发生

采用荧光紫杉醇直接荧光标记,研究了腹毛类纤毛虫阔口游仆虫(Euplotes eurystomus)中由纤毛器、纤毛器附属微管和非纤毛器微管组成的皮层微管胞器.其中纤毛器、纤毛器附属微管包括口围带及小膜托架微管,波动膜及基部微管骨架网,额腹横棘毛、左缘棘毛及基部的前纵维管束、后纵微管束和横微管束,背触毛及基部的玫瑰花环附属微管等;非纤毛器皮层微管包括背腹面的细小网格状微管,背面的斜向微管层及贯穿于细胞纵长的纵微管层等.形态发生中,老口围带被前仔虫继承,前、后仔虫的额腹横棘毛发生及分化过程中老纤毛器基部微管退化,并且老棘毛及其附属微管可能具有定位和定向作用,但未见直接的物质联系.所得结果为揭示腹毛目纤毛虫皮层微管胞器建构的多样性、细胞皮层微管的分化及其细胞调控提供了基础资料.     

鸡γ－干扰素表达载体的构建

采用PCR方法从peDNA-ChlFN-γ重组质粒中扩增得到鸡γ-干扰素基因.将目的基因定向克隆进能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE lxisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株.以IPTG诱导表达8xHis-tag 标签蛋白并对其进行纯化,通过SDS-PAGE检测方法表明,ChlFN-γ基因片段成功表达.     

八肋游仆虫一个新β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

从八肋游仆虫细胞中克隆到一种新的β-微管蛋白基因.序列分析结果表明:在大核中,该基因全长1561bp.与已经报道过的β-微管蛋白基因不同,它的5′端基因上游调控序列有49 bp,AT含量为75.5%.上游调控序列中仅有一个TATAA框,没有CCAAT框;该基因的3′端的下游调控序列有121 bp,富含AT碱基,达到86.8%,其中有明显的反向重复序列.上下游调控序列中各有一个断裂信号TTGAA和TTCAA,负责从小核到大核发育过程中大核染色体的形成.从小核基因组中克隆到相应的基因片段,比大核中的序列多7个碱基5′-CATGCTC-3′,其功能尚不清楚.序列比对表明,新的β-微管蛋白基因与已经报道的β-微管蛋白基因的同源性92.3%,阅读框中有2个氨基酸的变化,将它命名为β2-微管蛋白基因.     

八肋游仆虫蛋白激酶A的克隆及原核表达分析

为了研究低等真核生物中蛋白激酶PKA(cAMP-dependent protein kinase A)的生物学功能,以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为实验材料,通过生物信息学方法分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,发现八肋游仆虫中编码蛋白激酶PKAc(PKA催化亚基)的基因只有一种。通过PCR扩增获得游仆虫PKAc基因(EoPKAc),分析表明EoPKAc基因全长1158bp,不含有内含子,开放阅读框981bp,编码326个氨基酸。序列比对结果显示EoPKAc含有与其它已知蛋白激酶相同的11个亚结构域(subdomain)以及一些重要的保守氨基酸。构建原核表达质粒pGEX-6P-1-PKAc,转化至大肠杆菌BL21中,EoPKAc获得高效表达,经GST柱亲和层析后获得较高纯度的EoPKAc蛋白,表达产物经Western blotting检测为阳性。     

八肋游仆虫信息素在大肠杆菌中的表达

信息素在八肋游仆虫接合生殖过程中起着重要的诱导配对作用，为了进一步研究其诱导机制，根据已知的基因序列，应用PCR技术，扩增信息素G3基因，并将该基因插入表达载体pGEX-6P1中，构建了重组表达质粒pGEX-6P1-G3．重组菌在37℃下，经1．0mmol／L IPTG诱导，12％SDS-PAGE分析，在37kDa处出现明显的特异目的带。     

近亲游仆虫的无性生殖和皮层细胞骨架的研究 Ⅰ.形态和形态发生

应用蛋白银染色方法和扫描电子显微镜技术,首次详细地观察了近亲游仆虫(Euplotes affinis Dujardin)的形态和形态发生,并对新纤毛小器官原基的产生、发育和老纤毛器的关系等进行了讨论.     

八肋游仆虫组织蛋白酶B-1的克隆、表达和性质分析

为研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的生物学功能,选用组织蛋白酶B-1(EoCTSB-1)为研究对象,通过PCR扩增获得EoCTSB-1的基因。利用生物信息学软件分析表明八肋游仆虫CTSB-1基因全长为980bp,不含有内含子,开放阅读框为862bp,编码286个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示八肋游仆虫中组织蛋白酶B-1具有保守的催化活性位点,但缺少信号肽和封闭环结构。构建重组表达质粒pET30a-EoCTSB-1,并转入原核细胞中表达,经镍柱亲和层析以及变复性处理后获得较高纯度的EoCTSB-1蛋白,表达产物利用His-Tag的抗体进行western印迹检测,结果显示阳性。利用底物Z-Phe-Arg-AMC测得EoCTSB-1的最适温度为35℃,最适pH是5.0。     

包囊游仆虫纤毛器微管在不同生理状态下的分化

应用FLUTAX染色及荧光显微术研究了包囊游仆虫的皮层微管胞器及其形成包囊和脱包囊过程中结构的分化：（1）细胞无性分裂过程中，棘毛基部的毛基体由紧密聚集状态逐渐分离、瓦解和消失；背纤毛基体逐渐膨大，基体内的周围微管散开成梅花形，之后在相应皮层区发生由颗粒组成的条带形原基.（2）细胞形成包囊时，口围带、波动膜和额腹横棘毛等微管胞器经历了部分去分化的过程，伴随着细胞体的凝缩，其纤毛器相互聚集，定位于球形体包囊细胞腹面；背纤毛按原有模式排列，位于包囊细胞背面.（3）脱包囊过程中，细胞吸水膨大，细胞体分化成变形虫状并显示一致的弱荧光，但未见微管胞器的荧光图像；细胞通过包囊壁背面小孔脱囊而出，恢复成为正常形态的纤毛虫；此后，在细胞脱包囊后残留的包囊壁背壁尚保存有部分背纤毛的痕迹.根据所得结果推测,形态发生中，纤毛器微管对新结构的形成可能有物质联系或物质贡献；脱包囊时，细胞成变形虫状，其微管结构可能发生了解聚和再分化的过程.     

包囊游仆虫的皮层及其纤毛结构的形态学研究

应用光学显微镜和扫描电子显微镜研究了非分裂时期和分裂时期上海包囊游仆虫的皮层及其纤毛结构的形态学.形态发生中,纤毛原基按口原基,额腹横棘毛、尾棘毛、和背触毛原基的顺序先后在皮层内发生和分化,皮层相应位置也按序形成纤毛原基生长发育的空间.纤毛原基长纤毛时,其上方皮层表面裂开,伴同着新口围带逐渐外露,或新棘毛沿皮层裂口形成的沟槽迁移和定位.皮层表面突起中,唇和第二条脊经历生长发育和分裂的过程,被分配到前、后仔虫中,其中脊向仔细胞传递的这种现象是特殊的.所得结果表明,游仆虫的老口围带纤毛结构发生更新后形成前仔虫的口围带,并且前仔虫波动膜也可能是更新后产生的新结构.     

近亲游仆虫的无性生殖和皮层细胞骨架的研究——Ⅰ.形态和形态发生

应用蛋白银染色方法和扫描电子显微镜技术,首次详细地观察了近亲游仆虫(Euplotes affinis Dujardin)的形态和形态发生,并对新纤毛小器官原基的产生、发育和老纤毛器的关系等进行了讨论。     

包囊游仆虫的皮层及其纤毛结构的形态学研究

应用光学显微镜和扫描电子显微镜研究了非分裂时期和分裂时期上海包囊游仆虫的皮层及其纤毛结构的形态学。形态发生中,纤毛原基按口原基,额腹横棘毛、尾棘毛、和背触毛原基的顺序先后在皮层内发生和分化,皮层相应位置也按序形成纤毛原基生长发育的空间。纤毛原基长纤毛时,其上方皮层表面裂开,伴同着新口围带逐渐外露,或新棘毛沿皮层裂口形成的沟槽迁移和定位。皮层表面突起中,唇和第二条脊经历生长发育和分裂的过程,被分配到前、后仔虫中,其中脊向仔细胞传递的这种现象是特殊的。所得结果表明,游仆虫的老口围带纤毛结构发生更新后形成前仔虫的口围带,并且前仔虫波动膜也可能是更新后产生的新结构。     

果蝇微管互作蛋白的大规模筛选研究

微管是一种具有极性的、管状的细胞内动态结构，是细胞骨架的重要组分.一些跟微管相关的基因发生突变时，有可能致使严重的人类疾病的发生.这些相关基因编码的蛋白即为微管互作蛋白.影响微管的基因众多，目前发现的影响微管正常组装的蛋白还只是冰山一角，仍有诸多影响微管的互作蛋白等待人类“挖掘”.我们利用已有的果蝇RNAi文库，通过UAS/Gal4系统，对部分基因进行敲减(RNAi),使基因在果蝇幼虫肌肉中特异性沉默，经过免疫染色后观察这些基因功能敲降果蝇的肌肉微管形态，以此来筛选微管互作蛋白.我们共鉴定了541个基因，筛选出微管有表型的40个.其中一些基因在线粒体、内质网、高尔基体、过氧化物酶体等细胞器中具有特定的功能.因此，我们的筛选工作不仅为构建微管相关疾病模型提供了铺垫，为微管相关疾病治疗工作提供了一定的帮助；而且对细胞结构中微管的非中心体微管组织中心探究提供了思路.     

伍氏游仆虫无性生殖中前仔虫口围带的起源

关于伍氏游仆虫(Euplotes woodruffi)的形态和形态发生,已经有人应用银浸法和蛋白银染色等方法在光镜水平上做了深入的研究,有详细的报道.据光镜水平上的观察一般认为,游仆虫二分裂期间前仔虫口纤毛器是继承亲体上原有的老结构而来的.最近,作者应用扫描电镜方法在亚显微水平上发现,这种游仆虫无性生殖中前仔虫口围带是在原老口围带位置更新发育而来的.现将结果简报如下. 1材料和方法     

纤毛虫胞质微管及大核的FLUTAX-EB荧光标记方法

以游仆虫、尖毛虫和尾柱虫三种腹毛目纤毛虫为材料,在应用FLUTAX方法显示纤毛虫细胞微管结构的标本制备过程中,增加了EB染色的歩骤,使标记纤毛虫细胞皮层微管的同时也显示了细胞核的结构.并提出了实验中对EB浓度及渗透时间等需注意的方面.