紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的烟草转化

将所克隆的紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因(TaGST)构建成植物表达载体pBI-TaGST,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38(Nicotiana tabacum cv.W38),获得了转基因的烟草植株.转基因植株的PCR和RT-PCR检测表明,该目的基因已经整合到烟草基因组上.     

甜菜M14品系Cystatin基因植物蛋白纯化表达载体的构建及转化烟草

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一类具有提高植物对各种生物及非生物胁迫抗逆性的重要蛋白质。利用前期获得的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的编码区序列构建了带有His标签的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的植物蛋白纯化表达载体,并将其转化烟草,获得T0代阳性转基因植株,为下一步利用融合蛋白的His标签从转基因烟草中大量纯化甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂奠定了基础。     

甜菜BvM14-MADSbox基因启动子的组织特异性表达

MADS - box基因在植物的花器官和各种营养器官中均有不同形式的时空表达模式,行使不同功能.实验室前期获得了甜菜M14品系BvM14 - MADS box基因的特异启动子Pbm,并对其进行了瞬时表达.本试验利用含有重组载体pBI121 - Pbm - GUS的农杆菌转化烟草,对报告基因GUS在转基因烟草各组织表达特...     

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.     

CCoAOMT基因反义表达载体的构建及转化苎麻的研究

采用RT-PCR的方法,克隆烟草木质素合成关键酶咖啡酰甲基转移酶(CCoAOMT)基因并测序．构建CCoAOMT基因反义表达载体,通过农杆菌介导法对苎麻进行遗传转化,得到转基因植株．采用PCR方法对其进行分子检测．为利用基因工程技术,创造适合我国国情的环保型低木质素苎麻转基因新品种奠定了基础。     

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗，利用Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因．利用PCR扩增HEV ORF2基因，然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichia postoris分泌型表达载体pPIC9K的a-因子信号肽编码序列3’端，重组表达载体在电击转化毕赤酵母，经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后，证实HEV ORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子．表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达，用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株，再经SDS-PAGE与Western blot证实ORF2基因在Pichia pastoris中实现了分泌表达，而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性；同时用双抗体夹心法证实在Pichia pastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体．     

拟南芥胚胎发生基因LEC1对水稻胚胎发育的遗传学效应

从拟南芥的球型胚-心型胚期荚果cDNA中,通过特异引物PCR,克隆到胚胎发生调控基因LECl.将克隆的目的基因构建到植物表达载体pWM101中,将其置于35S启动子下游,并通过PCR和酶切实验验证,获得了在植物中组成型表达LECl的表达载体.提取表达载体质粒,用Nhe Ⅰ酶切质粒,使其成线型,通过花粉管通道法分别转化可育系水稻0099和不育系金23A.转基因的不育系金23A结种子,但胚乳发育缺陷,将胚乳缺陷的种子安于无激素的1/2 MS培养基中培养,其中有一株发芽,长成外观正常的植株,另一株则只长出根.提取其DNA,以特异引物P35S和P2进行检测,为阳性转基因个体.不经授粉,从不育系获得具萌发能力的种子,说明LECl基因在单子叶的农作物水稻中能促进胚胎发生.通过叶片基因组DNA特异引物PCR分子检测,证明从可育系水稻0099也获得阳性转基因植株.     

人角质细胞生长因子-1在水稻中的表达

人角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor,KGF）在组织的损伤修复中起着重要的作用.植物细胞生物反应器是一种成本低、安全性好的蛋白生产系统.本研究将人KGF-1经农杆菌介导法转入水稻中,共获得38株抗性再生植株.Southern杂交和RT-PCR结果表明KGF-1基因整合入水稻基因组中且部分转化株中KGF-1基因得到转录.Western blotting检测结果显示有两株转化水稻中能够表达KGF-1.     

LL-37/hCAP-18基因克隆及其真核表达载体的构建

LL-37 hCAP-18是一种重要的多功能免疫分子.为探讨hCAP-18在基因治疗中的可行性,应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1细胞总RNA中成功扩增出560bp的hCAP-18基因编码区cDNA序列,构建了hCAP-18重组表达质粒phCAP-18.采用脂质体法将质粒phCAP-18瞬时转染COS-7细胞,Westernblot证实,hCAP-18能在COS-7细胞中表达.     

运用农杆菌介导的瞬时表达体系研究PDS基因沉默

农杆菌介导的瞬时表达体系是一个研究整株植物基因沉默的快速实用系统.本文介绍了运用该系统研究马铃薯X病毒诱导烟草(Nicotiana benthamianan benthamiana)八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因的沉默问题.实验结果表明:携带有与PDS基因同源的409个碱基大小的cDNA片段的重组的马铃薯X病毒载体抑制了内源的PDS基因的表达.     

LBM2eHBc＋融合基因植物表达载体构建及对番茄的转化研究

禽流感病毒一直是家禽和家畜健康养殖的巨大威胁,甚至威胁着人类的健康,人们也一直在研究各种形式的疫苗来应对禽流感病毒的威胁.番茄作为生物反应器应用于动物疫苗生产具有独特的优点,本研究优化了番茄子叶的再生体系,同时构建了LBM2eHBc＋融合基因的植物表达载体并对番茄进行了遗传转化.结果表明在玉米素（Zt）浓度为0.5 mg/L时番茄子叶外植体的芽再生率达到93.33%;测序结果证明植物表达载体pBI121-LBM2eHBc＋构建成功;利用农杆菌介导的转化方法获得再生抗性苗34株,经PCR检测,阳性率为75.0%,本研究结果为进一步开发禽流感口服疫苗奠定了基础.     

基因枪法导入cyclAt和GUS基因获得转基因水稻

以cyclAt基因为目的基因,HPT和GUS为选择和报告基因,应用PDS-1 000/He型基因枪协同转导,通过轰击来源于水稻成熟种子诱导产生的胚性愈伤组织,获得了转基因水稻植株.结果表明:通过X-Gluc染色分析,GUS基因在愈伤组织和再生植株叶片中的表达效率高.以转基因植株的基因组DNA为模板,用cyclAt基因的特异性引物对其进行PCR扩增,只检测到1 000 bp左右的片段,比其1 604 bp的完整序列小,因此推测cyc1At基因在转导入水稻后被剪接.此外,在协同转导过程中,cyc1At和GUS可能与受体基因组DNA随机整合,因此视GUS基因为报告基因有一定局限性;但两者同时被整合的频率远高于单一基因的整合.     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭（Anas platyrhynchos domesticus）和绿头野鸭（Anas platyrhynchos）卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA（同源性为96%）、褐家鼠睾丸cDNA（同源性为83%）有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

果蝇血液标记基因srp原核表达质粒构建及多克隆抗体制备

果蝇基因srp是血液发育的早期标记基因,为了研究果蝇这一模式动物中血液发育的详尽过程,通过提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,设计引物克隆出srp基因,将所得片段插入原核表达载体pET28a中,经酶切和序列鉴定,成功构建重组质粒,并通过IPTG诱导表达出His-srp融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯...     

香蕉基因工程研究进展

香蕉微繁殖技术日趋成熟,为香蕉基因工程遗传转化提供了良好的受体材料,目前已获得成功的转基因香蕉植株.但将抗病、虫基因成功导入香蕉并获得抗病、虫植株还未见报道.     

Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备

Pericardin 基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin 基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogal actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot 检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin 多克隆抗体,为Pericardin 功能的进一步研究奠定了基础.     

烟草叶片细胞分离方法与扫描电镜观察

比较研究了烟草叶片细胞分离条件及分离细胞制备扫描电镜观测样品的方法，成功地获得了烟草叶片的分离细胞。通过对不同部位叶片分离细胞进行电镜观察，发现不同部位叶片细胞的结构存在某些规律性的差异。