基因枪法导入cyclAt和GUS基因获得转基因水稻

以cyclAt基因为目的基因,HPT和GUS为选择和报告基因,应用PDS-1 000/He型基因枪协同转导,通过轰击来源于水稻成熟种子诱导产生的胚性愈伤组织,获得了转基因水稻植株.结果表明:通过X-Gluc染色分析,GUS基因在愈伤组织和再生植株叶片中的表达效率高.以转基因植株的基因组DNA为模板,用cyclAt基因的特异性引物对其进行PCR扩增,只检测到1 000 bp左右的片段,比其1 604 bp的完整序列小,因此推测cyc1At基因在转导入水稻后被剪接.此外,在协同转导过程中,cyc1At和GUS可能与受体基因组DNA随机整合,因此视GUS基因为报告基因有一定局限性;但两者同时被整合的频率远高于单一基因的整合.     

拟南芥FIE基因特异片段的克隆及序列测定

根据拟南芥FIE基因的序列设计PCR引物,以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增FIE基因特异性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为1633bp,与预期结果相符。将该基因片段定向克隆到pGEM-T载体上,得到重组质粒p1633,酶切鉴定及测序分析结果表明该克隆为拟南芥FIE基因特异片段,与拟南芥FIE基因比较同源性达99.8％,可以作为探针使用。     

nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的烟草转化

将所克隆的紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因(TaGST)构建成植物表达载体pBI-TaGST,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38(Nicotiana tabacum cv.W38),获得了转基因的烟草植株.转基因植株的PCR和RT-PCR检测表明,该目的基因已经整合到烟草基因组上.     

C_3启动子克隆及荧光素酶报告基因载体构建

为克隆C_3基因启动子序列,构建C_3基因启动子荧光素酶报告基因载体,运用PCR的方法从血液中提取到的基因组DNA中获得目的基因,双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建C_3基因启动子报告基因载体.构建的pGL3-Basic-C_3-promotor重组质粒和内参质粒SV40瞬时转染Hela细胞,检测荧光素酶活性.结果表明,PCR扩增出C_3基因启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染Hela细胞后经双荧光素酶报告基因检测确定重组体有启动子活性.成功构建了C_3启动子报告基因载体,在细胞系中进行初步活性分析得知所克隆的C_3基因调控序列包含启动子活性区域.     

利用靶拟态合成和Gateway技术构建水稻miR164c沉默突变体

以水稻基因组DNA为模板,PCR扩增得到与miR399互补的Os MIM399后,改造成与miR164c互补的靶拟态序列Os MIM164c,经测序分析后连入p GWC载体,获得入门载体p GWC-Os MIM164c;利用Gateway技术,将入门载体p GWC-Os MIM164c经LR反应连接到植物表达载体GCS中,获得GCS-Os MIM164c表达载体,经农杆菌介导将该表达载体导入水稻品种Kasalath的愈伤组织中,组织培养后获得再生植株并进行目的基因的PCR鉴定,Real Time PCR方法检测阳性突变体植株中miR164c的表达量.研究结果表明,miR164c在突变体植株中的表达量显著低于野生型,说明miR164c沉默突变体构建成功.     

人源抗菌肽LL-37在烟草中的表达

为探讨用植物生物反应器生产LL-37的可行性,利用DNA重组技术将LL-37与植物病程相关蛋白信号肽基因融合,经测序证实序列和阅读框正确后,连接到质粒pBin438上,构建含LL-37 cDNA植物分泌型表达载体pBin/LL-37.通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)介叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum.NC-89).用PCR和Western blot对转化植株进行分子鉴定.80%转基因植株表达重组LL-37多肽.T0代转基因烟草的蛋白粗提物有抑制Staphylococcus aureus和Escherichia coli生长的活性.LL-37基因在转基因烟草中成功表达,提示用植物表达系统生产活性LL-37蛋白是可行的.     

甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox启动子的克隆及序列分析

甜菜M14品系是带有白花甜菜染色体的栽培甜菜单体附加系,其染色体组成中除了包含18条栽培甜菜染色体外,还附加有白花甜菜第9号染色体,具有无融合生殖特性,无融合生殖能够固定杂种优势.在前期工作中,通过SSH、RACE等技术获得了甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox的eDNA全长.通过6种限制性内切酶分别酶切M14品系基因组总DNA,再与相应接头连接,构建了6个DNA步移文库.根据基因BvM14-MADSbox cDNA序列设计引物,通过染色体步移技术克隆出该基因的上游DNA序列.经生物信息学分析,推测获得了BvM14-MADSbox基因上游1 718 bp的启动子序列,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CCAAT-box,和ARE、ERE、HSE、ABRE、CGTCA-motif等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件.该结果为今后BvM14-MADSbox基因的时空特异性表达调控机制奠定基础.     

果蝇血液标记基因srp原核表达质粒构建及多克隆抗体制备

果蝇基因srp是血液发育的早期标记基因,为了研究果蝇这一模式动物中血液发育的详尽过程,通过提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,设计引物克隆出srp基因,将所得片段插入原核表达载体pET28a中,经酶切和序列鉴定,成功构建重组质粒,并通过IPTG诱导表达出His-srp融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯...     

CCoAOMT基因反义表达载体的构建及转化苎麻的研究

采用RT-PCR的方法,克隆烟草木质素合成关键酶咖啡酰甲基转移酶(CCoAOMT)基因并测序．构建CCoAOMT基因反义表达载体,通过农杆菌介导法对苎麻进行遗传转化,得到转基因植株．采用PCR方法对其进行分子检测．为利用基因工程技术,创造适合我国国情的环保型低木质素苎麻转基因新品种奠定了基础。