K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶基因的定点突变及其性能研究

针对菌株K.pneumoniae XJPD—Li高效转化生产1,3-丙二醇的特性,将其甘油脱水酶与已知报道的甘油脱水酶（U60992）的序列比对分析,根据差异位点设计了Nβ471的定点突变,利用反向PCR定点突变技术构建了甘油脱水酶（dhaBCE）的突变体质粒M1821,并在E．coli BL21（DE3）中高效表达。SDS—PAGE结果显示,诱导表达后在相对分子质量66、24、16KD出现三条特征条带,与预期结果一致。突变体M1821甘油脱水酶的比酶活为38．7U／mg,催化反应最适pH为8．0,最适温度为40℃,与未突变重组甘油脱水酶比较,最适温度降低了约5℃。     

罗伊乳杆菌转化甘油能力的原位再激活

考察罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)静息细胞转化甘油的重复利用,甘油脱水酶的原位再激活,以及补加培养基对再激活甘油脱水酶的变化.结果表明:菌体经二次转化后基本丧失转化能力,甘油对胞内甘油脱水酶具有强烈的抑制灭活作用;确证胞内存在甘油脱水酶再激活体系;不具转化甘油能力的L.reuteri可被补加的培养基在一定程度上再激...     

甘油脱水酶的研究进展

甘油脱水酶是微生物发酵法生产3-羟基丙醛和1,3-丙二醇过程中的关键限速酶.文中对甘油脱水酶的结构与功能、作用机制、基因工程研究等情况进行综述,探讨了甘油脱水酶的研究进展并提出一些建议.     

Klebsilla pneumoniae XJ-Li甘油脱水酶的催化反应特性

以自主筛选的Klebsilla pneumoniae XJ-Li为甘油脱水酶酶源,研究了其催化反应特性和稳定性。结果表明,甘油脱水酶的最适催化反应温度和pH分别为40℃和8．0。温度在40℃以下,pH处于6．0～8．0之间时酶的稳定性较好。在常见金属离子中,Mg2＋和Mn2＋对甘油脱水酶的催化反应具有一定促进作用,而Ca2＋、Co2＋、Fe3＋、Zn2＋和Cu2＋对其活性均有抑制作用。此酶对甘油的最高耐受反应浓度在0．15mol／L左右,对1,2一丙二醇的饱和浓度在0．3mol／L左右,以甘油和1,2-丙二醇为底物时的反应动力学常数Km值分别5．57mmol／L和8．16mmol／L。     

两种策略实现1,3-丙二醇关键酶基因的共表达

甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是甘油歧化为1,3-丙二醇(1,3-PD)的两个关键酶。采用多顺反子重组和质粒共存两种策略,对来自克雷伯肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)的两个关键酶进行共表达。构建表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT将两酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔,在E.coli BL21(DE3)高水平共表达了GDHt 3个亚基和PDOR,表达蛋白分别约占菌体总蛋白的18%、9%、7%和9%。质粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共转化E.coli BL21(DE3)得到稳定的双质粒系统,48h后84%的细胞能同时含有两种质粒,GDHt 3亚基和PDOR分别约占菌体总蛋白的16%、8%、6%和14%。两种酶在两种表达方法下均显示高于原始菌株的酶活力。     

Klebsilla pneumonia XJ-Li甘油脱水酶产酶条件研究

甘油脱水酶是生物法合成1，3-丙二醇的关键限速酶，对1，3-丙二醇的合成速度和发酵终浓度具有重要的影响。本文通过实验研究了Klebsilla pneumomae XJ-Li的基础产酶条件，结果表明：该菌株甘油脱水酶的合成与菌体的生长具有较好的偶联性，发酵8h即可达到最大产酶高峰，同时菌体生长也达到稳定期；其最适产酶条件为：温度40℃，oH值8．0，甘油浓度20g／L，氮源为6．0g／L的硫酸铵。     

重组Pol D DNA聚合酶的纯化及其功能初步研究

为研究古菌Pol D DNA聚合酶两个亚基的功能及其相互作用,对重组超嗜热硫还原古菌Thermococcus sp.4557 Pol D DNA聚合酶小亚基DP1和大亚基DP2进行柱层析纯化,采用荧光标记核酸结合聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对两个亚基体外功能进行研究。结果表明,DP2具有DNA复制延伸活性,DP1具有3''→5''外切核酸酶活性;DP1在与DP2的浓度比高于0.3∶1时可降解DP2的延伸产物;DP2对DP1的外切核酸酶活性有促进作用,Sld5和Psf1蛋白复合体(Sld5 and Psf1 Complex,GINS 51)对DP1的外切核酸酶活性有抑制作用。古菌Pol D DNA聚合酶大小亚基的功能及其相互作用对DNA复制机制的进一步认识有借鉴意义。     

肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因过表达与NAD~+再生的耦合

在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中超表达内源甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC,同时引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1,得到耦合3-羟基丙酸(3-HP)合成与NAD+再生的重组菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)。微氧摇瓶发酵结果显示在15h时3-HP产量达到1.45g/L,是携带空载体菌的2.39倍。分析是遗传扰动影响了底物甘油的代谢流量分配,从而提高了3-羟基丙酸的产量。     

辅酶依赖型和不依赖型甘油脱水酶的比较

实验比较源自肺炎克氏杆菌(K.pneumoniae)和丁酸梭状芽孢杆菌(C.butyricum)中的甘油脱水酶(GDHt)的辅酶依赖特性.采用生物信息学的方法,对两种酶的异同点进行分析,发现两种酶结构上相似性较低、亲缘性较远、分属于两个不同的家族.SMART数据库搜索结果表明,C.butyricum中不依赖辅酶的甘油脱水酶及其再激活酶,分别属于gly-Radical和Radical-SAM家族,多序列比对得到的一段富含半胱氨酸残基C**C**C的保守序列正是其共同特征.     

肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因过表达与NAD+

在肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中超表达内源甘油脱水酶基因 dhaB 和醛脱氢酶基因 puuC,同时引入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的3-磷酸甘油脱氢酶基因 GPD1,得到耦合3-羟基丙酸（3-HP）合成与NAD⁺再生的重组菌 K.p (pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)。微氧摇瓶发酵结果显示在15h 时3-HP产量达到1.45 g/L,是携带空载体菌的2.39倍。分析是遗传扰动影响了底物甘油的代谢流量分配,从而提高了3-羟基丙酸的产量。     

杂色鲍碱性磷酸酶在DMSO溶液中的活力与构象变化的研究

以二甲亚砜（DMSO）为效应物．研究其对杂色鲍碱性磷酸酶（ALP）活力的影响，结果表明：该酶的剩余活力随着DMSO浓度增大而迅速下降，当DMSO浓度达40％，酶活力几乎完全丧失．说明DMSO对杂色鲍ALP有明显的失活作用．导致酶活力丧失50％的DMSO浓度为17％．在较低DMSO浓度（〈20％）的失活是可逆的反应过程．动力学研究表明，该酶的失活过程属于混合型．进一步测定游离酶（E）和酶底物络合物（ES）与DMSO的结合常数（K1和K1s），结果表明K1〈K1s即说明底物存在对酶被DMSO的失活作用有一定的保护作用．应用荧光发射光谱研究杂色鲍ALP经DMSO微扰后的分子构象变化情况，随着DMSO浓度增大，荧光强度逐渐增强．但发射峰未发生明显变化现象．说明酶分子中的生色基团残基的微环境发生了一定的变化．     

亚热带基岩海岸防护林土壤的酶活性

研究了我国亚热带基岩海岩主要防护林类型土壤酶活性持征,指出在3种磷酸酶中,酸性磷酸酶活性大于碱性,中性磷酸酶活性。3种磷酸酶与总磷酸酶活性密切相关,但以碱性磷酸酶相关性最高,中性磷酸酶次之,酸性磷酸酸最小。4类土壤酶活性自上而下均逐渐减少。不同森林类型土壤酶活性差异显,林龄越大活性越高,经济林受人为干扰,土壤酶活性居中低水,应采用合理的经营管理措施。     

乙醇对鲍鱼碱性磷酸酶活力与构象的影响

以乙醇为效应物研究对鲍鱼碱性磷酸酶(ALP)活力影响的结果表明．酶的剩余活力随着乙醇浓度增大而迅速下降，乙醇浓度40％可使酶活力完全丧失．说明乙醇对鲍鱼ALP有明显的失活作用，JG50为13％．含较低浓度乙醇(30％)的失活过程是可逆的反应．测定乙醇对酶的失活作用机理．结果表明乙醇对鲍鱼ALP的失活作用是非竞争性机制，说明底物存在不影响乙醇对酶的失活作用．应用荧光光谱、紫外吸收光谱研究鲍鱼ALP经乙醇微扰后的分子构象变化，发现乙醇对酶分子构象有显的影响，酶的内源荧光强度随乙醇浓度增大而增强．荧光发射峰逐渐发生红移．紫外吸收光谱在276nm吸收峰随乙醇浓度增大而增强．这些结果表明．酶蛋白分子中的生色基团残基的微环境发生变化．     

西芹腐根浸提液处理后黄瓜枯萎病菌致弱机制

 室内条件下用西芹腐根乙醇、丙酮和蒸馏水浸提液,连续5 代处理黄瓜枯萎病菌,测定处理后黄瓜枯萎病菌分泌的镰刀菌酸量和细胞壁降解酶活性及其与致病力的相关关系,以揭示西芹腐根浸提液连续多代处理黄瓜枯萎病菌的致弱机制。结果表明,各处理的致病力随接种代数的增加逐渐减小,镰刀菌酸质量浓度和果胶酶活性随培养代数的增加逐代减少,纤维素酶活性随培养代数的增加无明显的变化规律,β-葡萄糖苷酶活性随培养代数的增加逐代升高,但均表现为处理低于对照。相关分析表明,致病力与菌体分泌的镰刀菌酸质量浓度和果胶酶活性均表现为显著或极显著的正相关关系,与纤维素酶活性相关性不显著;与培养第3~5 代β-葡萄糖苷酶活性表现为显著或极显著的正相关关系。     

一株来源于酒曲的纤溶酶产生菌的鉴定及其酶学性质

从酒曲中分离到一株纤溶酶产生菌,经形态及ITS序列分析鉴定为菊芋小孢根霉(Rhizopus microsporus var.tuberosus).酶学性质研究表明,该纤溶酶的最适作用温度为37,℃,最适作用pH为7.0.在37,℃保温4,h酶活力仍保存95%,57,℃下保温4,h后仍有一定酶活.该酶具有广泛的酸碱适应性,在pH<3.4时仍残留部分活性;最稳定的pH范围是6～8.Zn2+、Cu2+对酶活有抑制作用,Na+、Ca2+、Mn2+对酶活具有明显的促进作用.该酶在人工肠液中具有较好的稳定性,37℃保温4 h后残余酶活仍然保持在80%以上,有望制成注射剂应用于临床.     

黑曲霉HD－404酸性蛋白酶若干动力学性质的研究

研究金属离子、ＥＤＴＡ、表面活性剂、碘乙酸等对黑曲霉ＨＤ－４０４酸性蛋白酶活力的影响的结果表明：Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋对酶有明显的激活作用；Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋和Ａｌ３＋同时使用时，产生协同效应，显著提高酶活力；十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、西湖高效洗洁剂对酶有明显的抑制作用；在以酪蛋白为底物时．ＡｇＮＯ３是酶的不可逆抑制剂．     

DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究

鉴于纤维素酶研究和生产中,纤维素酶活力测定和酶活力单位的表示方法很不统一的现象,本文研究和分析了３,５－二硝基水杨酸法测定羧甲基纤维素酶糖化力的实验条件,如：温度、ｐＨ、酶促反应时间、ＤＮＳ显色时间、波长等．实验表明：在５０℃,ｐＨ４．６条件下酶促反应时间５ｍｉｎ,ＤＮＳ显色５ｍｉｎ,于４９０ｎｍ处测定ＯＤ值比较适宜．     

Discovery and Content Variation Analysis of Fibrinolytic Enzyme in Semen Sojae Praeparatum Fermentation

A strong fibrinolytic activity was demonstrated in the Semen Sojae Praeparatum(SSP), which is a famous traditional Chinese medicine. To study the activities and dynamic changes of fibrinolytic enzyme, standard fibrin plate was used to determine the fibrinolytic activity. For the first time fibrinolytic enzyme was found during the fermentation of SSP and the fibrinolytic activities of samples were shown to increase significantly over time. In the "yellow cladding" stage, the fibrinolytic activity was 619.75 IU/g. On day 6, 12 and 15 of the "secondary fermentation" stage, the fibrinolytic activity was 711.49 IU/g, 866.67 IU/g, 1 022.31 IU/g, respectively. The results indicate that fibrinolytic enzyme was generated during the fermentation of SSP and it displayed increasing activity which peaked at the "secondary fermentation" stage. The fibrinolytic enzyme was found to not only degrades fibrin directly, but also activate plasminogen to do so.     

葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶共固定研究

以弱碱性阴离子交换树脂D301T为载体,对过氧化氢酶（CAT）和葡萄糖氧化酶（GOD）两种酶进行分次固定,并对固定化条件进行了优化。所得最佳工艺条件为：共固定化酶采用先固定CAT,再固定GOD的顺序进行,其中CAT 0.5 mL,GOD 0.25 mL。所得CAT蛋白结合量为1.07 mg/g,固定化效率为46.71%;GOD蛋白结合量为1.58 mg/g,固定化效率为43.62%;每mL GOD酶液的表观酶活为47.98 U/mL,每g载体中GOD的酶活为12.0 U/g。以戊二醛作为交联剂,体积分数取0.5%,交联时间取15 min时,所得固定化酶表观酶活达到最大值,为14.66 U/g,固定化酶连续反应10批后,其酶活为初始值的85.3%,显示出固定化酶具有良好的操作稳定性。     

黑曲霉HD-404酸性蛋白酶若干动力学性质的研究

研究金属离子、EDTA、表面活性剂、碘乙醚等对黑曲霉HD-404酸性蛋白酶活力的影响的结果表明:Cu~(2+)、Mn~(2+)对酶有明显的激活作用;Cu~(2+)、Mn~(2+)和Al~(3+)同时使用时,产生协同效应,显著提高酶活力;十二烷基磺酸钠(SDS)、西湖高效洗洁剂对酶有明显的抑制作用;在以酪蛋白为底物时,AgNO_3是酶的不可逆抑制剂。