利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术

piggyBac转座子元件被成功应用于家蚕转基因. EGFP荧光蛋白基因作为筛选标志, 受含有Pax-6结合位点的启动子控制, 并能在家蚕的眼部组织中特异性表达. 荧光筛选质粒和piggyBac转座子表达质粒被以混合物的形式显微注射到家蚕受精卵, 获得出生的G₀代蛾子700个, 互相交配后, 利用EGFP荧光筛选获得111个独立的转基因系. 大部分转基因系在基因组上携有2个或多个插入拷贝, 并且在整个项目过程中转基因的表型稳定遗传6代以上. 对插入位点的序列鉴定发现, 其插入位点两侧具有特异性TTAA序列, 证实转基因的插入受到piggyBac转座子的调控. 高效稳定的家蚕转基因技术的建立为家蚕后基因组的研究和蚕业工业的发展提供了基础.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

基于BAC同源重组高效构建小鼠胚胎干细胞Nanog基因报告体系

Nanog是最新发现的一个在胚胎干细胞(ES细胞)中特异表达, 并在保持ES细胞多能性的机制中有重要作用的转录因子. Nanog基因的表达能非常灵敏地随ES细胞的分化而下调, 使之成为指示ES细胞多能性最理想的标志基因之一. 本研究基于细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)同源重组技术, 并改进了将报告基因敲入目的位点的重组方案, 高效构建了小鼠ES细胞(mES细胞)的Nanog/EGFP报告体系. 基因打靶后的mES细胞具有与其源mES细胞相同的特性, 并能稳定地将Nanog与EGFP (enhanced green fluorescence protein)的表达偶联. 此报告体系能通过EGFP的表达有效报告Nanog基因的表达水平, 从而对mES细胞分化或未分化状态作出明显指示. 本研究为mES细胞自我更新和分化的研究提供了一个理想的实验体系, 不仅能用于进一步优化mES细胞的培养体系, 对研究Nanog的表达调控及其与其他维持mES细胞多能性的因子和途径之间的关系也有深远的意义.     

通过叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因

构建了含phbB, phbA, phbC和aadA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体, 通过基因枪轰击法转化烟草. 对具壮观霉素抗性的植株进行PCR和Southern等分析, 确证外源基因已整合到叶绿体基因组中, 同时测定了其同质化程度. Northern点杂交、RT-PCR分析结果表明, 叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因, 并且未观察到基因沉默现象. 叶绿体型转基因植株还具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点, 表明叶绿体基因工程在转基因植物生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)方面极具潜力.     

转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶

人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽, 具有抗菌、抗病毒和增强免疫力的功能, 对生物体的自身防御起着重要作用. 为研究乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶和提高牛奶的免疫活性, 制备了以溶菌酶基因组序列为目标基因的表达载体的转基因小鼠模型. 经转基因小鼠的制备, 通过PCR和Southern blot 检测, 从83只出生小鼠中获得6只整合人溶菌酶融合基因的转基因小鼠. 对F1代小鼠的PCR检测表明外源基因可以遗传给后代. 在3只转基因阳性母鼠的乳汁中, 用Western blot方法可以检测到重组人溶菌酶的存在, 最高表达量达到0.2 mg/mL. 经活性检测, 转基因小鼠乳清的溶菌酶活性显著提高, 已达到人乳清溶菌酶活性的0.4倍, 而非转基因小鼠乳清具有极低的溶菌酶活性. 尽管转基因小鼠乳清中重组人溶菌酶活性还低于人乳清中溶菌酶活性, 但是转基因小鼠乳汁中的重组人溶菌酶与人溶菌酶具有相同的比活力. 为乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶的研究和开发应用打下了坚实的基础.     

一种简单有效的检测基因表达产物的方法

外源基因转入动植物细胞后在释译水平上正确表达产物的定性定量测定是基因工程中的重要问题,通常生物中某些酶的含量很低,如异戊烯基转移酶,在进行其转基因研究时较难测定。根据其ｃＤＮＡ序列,预测出抗原位点肽并用固相法合成,与载体蛋白偶联后获得对其起专一性反应的抗体,用该抗体通过ＥＬＩＳＡ法可以有效测定转基因烟草中的基因表达产物。为测定难以分离纯化的低含量的基因表达产物提供了一种简便而有效的方法。     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

基因枪介导质粒共转化整合模式的FISH研究

利用多色荧光原位杂交（Multi-color FISH)，在基因枪介导共转化的转基因水稻中检出了目的基因barnase-psl片段和报告基因pHcintG。在供试两单株的染色体上，这两个外源基因各有2－3个整合位点。多数情况下，barnase-psl片段与pHcintG整合在染色体的同一位置。同时，选株Q13的伸展DNA纤维荧光原位杂交（Fiber FISH)显示，两基因表现为衔接重复，重复间具有短的间隔。结合Southern杂交结果，对基因枪介导共转化可能的整合模式进行了分析。     

粉尘螨过敏原在转基因植物中的致敏活性分析

在转基因食品潜在致敏性的研究中, 将粉尘螨过敏原基因(Derf₂)引入植物中表达. 经PCR, Southern和Northern杂交以及ELISA检测证明, 外源基因已发生整合并正常表达, 表明转基因烟草作为一个实验系统来研究基因产物的致敏性是可行的. 同时, 采用RT-PCR从转基因烟草中扩增出经植物加工后的致敏原基因Derf₂片段, 序列比对证明植物(烟草)能对动物(粉尘螨)的内含子进行正确识别和有效剪切.     

基因的瞄准器：基因靶向技术 ——评2007年诺贝尔生理学或医学奖

2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇和奥利弗•史密斯、英国科学家马丁•埃文斯因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”(即“基因靶向”技术)而获此殊荣，该技术在研究基因的功能以及建立人类疾病模型等方面开创了一个全新思维模式和技术手段。本文将就“基因靶向”技术作一简要介绍。     

Zebrafish:A Renewed Model System For Functional Genomics

In the post genome era, a major goal in molecular biology is to determine the function of the many thousands of genes present in the vertebrate genome. The zebrafish （ Danio redo） provides an almost ideal genetic model to identify the biological roles of these novel genes, in part because their embryos are transparent and develop rapidly, The zebrafish has many advantages over mouse for genome-wide mutagenesis studies, allowing for easier, cheaper and faster functional characterization of novel genes in the vertebrate genome. Many molecular research tools such as chemical mutagenesis, transgenesis , gene trapping, gene knockdown,     

应用分子生物学方法诱导植物雄性不育:生物学基础和前景

本文着重介绍了花药和花粉发育过程中基因表达的特点和复杂性,花药和花粉的特异性基因以及特异性基因的调节等方面的研究进展,讨论了应用上述特异性基因的调节序列与一定的目的基因(如核糖核酸酶基因)构建的嵌合基因诱导植物雄性不育的前景和这种分子生物学方法在作物杂种优势利用过程中遇到的问题。     

江苏如东近海绿潮藻分子检测与类群演替分析

2007年以来,中国青岛、连云港、如东等黄海沿海连续4年爆发绿潮现象,尤其2008年青岛爆发了世界最大规模绿潮,造成了严重的生态危害.2009年,我们对江苏省如东海域绿潮藻进行了调查和监测,选取紫菜养殖架和防波堤坝上的11个固着样品以及海区15个漂浮样品,对其ITS及5.8S rDNA和叶绿体rbcL基因序列进行了分子系统发育和类群演替分析.结果显示,如东沿岸堤坝和紫菜养殖筏架具有大量固着生长的浒苔类绿潮藻,其海区漂浮绿潮藻团出现时间也最早,并逐渐北移;ITS序列分析将如东样品聚为5个类群,即Ulva compressa类群(6个样品)、Ulva linza-procera-prolifera(LPP)复合体类群(12个样品)、Ulva flexuosa类群(3个样品)、Blidingia sp.类群(3个样品)以及Urospora spp.类群(2个样品),而rbcL序列较为保守,26个样品只聚为4个类群.DNA序列分析表明,如东海区漂浮与固着绿潮藻类群构成相同,亲缘关系较近,漂浮绿潮藻优势类群先后出现次序为:U.compressa,U.flexuosa及LPP,最终漂浮种与2008年黄海绿潮优势种的ITS...     

江苏如东近海绿潮藻分子检测与类群演替分析

2007 年以来, 中国青岛、连云港、如东等黄海沿海连续4 年爆发绿潮现象, 尤其2008 年青岛爆发了世界最大规模绿潮, 造成了严重的生态危害. 2009 年, 我们对江苏省如东海域绿潮藻进行了调查和监测, 选取紫菜养殖架和防波堤坝上的11 个固着样品以及海区15 个漂浮样品, 对其ITS及5.8S rDNA 和叶绿体rbcL 基因序列进行了分子系统发育和类群演替分析. 结果显示, 如东沿岸堤坝和紫菜养殖筏架具有大量固着生长的浒苔类绿潮藻, 其海区漂浮绿潮藻团出现时间也最早,并逐渐北移; ITS 序列分析将如东样品聚为5 个类群, 即Ulva compressa 类群(6 个样品)、Ulva linza-procera-prolifera (LPP)复合体类群(12 个样品)、Ulva flexuosa 类群(3 个样品)、Blidingia sp.类群(3 个样品)以及Urospora spp.类群(2 个样品), 而rbcL 序列较为保守, 26 个样品只聚为4 个类群.DNA 序列分析表明, 如东海区漂浮与固着绿潮藻类群构成相同, 亲缘关系较近, 漂浮绿潮藻优势类群先后出现次序为: U. compressa, U. flexuosa 及LPP, 最终漂浮种与2008 年黄海绿潮优势种的ITS 序列完全相同. 本研究为今后黄海绿潮溯源及其预测防控奠定了重要基础.     

Investigation on Hepatopoietin and Other Novel Genes from Human Fetal Liver

The aim of this study is to discover the molecular mechanism of the 22-week gestated human fetal liver(HFL)which rarely displays both hematopoietic and hepatic functions. Based on large-scale cDNA library sequencing and bioinformatic analysis, the largest     

基于二硫键桥连构建均一性抗体药物偶联物

抗体药物偶联物(ADCs)通过一个化学链接将具高活性药物分子连接到抗体上,协同发挥药物分子的高活性和抗体药物的靶向性的优点,降低毒性,实现靶向精准的疗效。目前已经有10个ADCs陆续上市。在新一代的ADCs发展中定位偶联获得药物–抗体比例(DAR)可控、均一性高的ADCs非常重要。近几年,基于抗体中二硫键先还原再桥连而发展的 “ThioBridge” 技术逐渐显示出其优越性,如用化学方法实现直接对天然抗体的定位修饰、适用性广、DAR值可控、所得 ADCs均一性高等。文章侧重于介绍二硫键桥连构建ADCs的方法和进展。     

非达尔文自然选择—一种新的进化动力

本文从作者之一于１９９１年提出的基因表达的诱导和阻遏效应的数学模型中引出一种新的生物进化动力假说，即环境因素对基因表达的选择。此种选择机制在选择对象，选择水平和选择效应等方面都不同于达尔文提出的自然选择。所以称为非达尔文自然选择。它的理论依据是一个物种所含有的遗传信息量远远大于其整个形态结构所表现的遗传信息量以及基因表达的操纵子诱导和阻遏模型。本文认为一个祖先种的基因库可能含有许多可选择的基因表达系统，且基因库容量越大，就越有可能存在有序度越高的基因表达系统内形成有序度越高的形态结构。此外，本文还提出了绝对遗传型和相对遗传型概念，讨论了非达尔文自然选择与达尔文自然选择及中性进化的关系。     

基于金纳米棒基因探针对多元基因的识别与检测

通过晶种生长法制备长径比分别为4:1 和8:1 的金纳米棒, 分别在其表面修饰上抑癌基因p53 和pTEN 2 种不同序列的模型基因片段, 构建金纳米棒基因探针, 这两种基因探针分别于800 和1100 nm 处有2 个近红外吸收峰. 基于探针基因识别靶基因时, 金纳米棒的纵向等离子共振吸收峰吸光度的变化, 对2种靶基因片段混合体系建立特异性识别及检测方法. 结果表明, 在pH 为7.0 的PBS 缓冲溶液中, NaCl 浓度为0.2mol/L 时, 在靶基因片段的浓度为3.0~9.0 nmol/L 范围内, 金纳米棒的纵向等离子共振吸收峰的变化与靶基因的浓度成线性关系, 检出限分别为1.6 和1.2 nmol/L. 实现了在同一混合体系中同时对两种靶基因片段的特异性识别及检测.     

C2H2锌指蛋白药物递送技术的研发与应用

锌指蛋白是真核生物中广泛存在的转录因子，在基因的表达调控中起着重要作用。近期研究发现，C₂H₂类型的锌指蛋白(通过两个半胱氨酸和两个组氨酸螯合锌离子)可通过巨胞饮进入哺乳动物细胞。进一步的研究发现C₂H₂锌指蛋白可介导多种模式蛋白质及药物蛋白质的高效细胞递送，其细胞穿透效率亦高于传统的细胞穿膜肽。文章介绍了锌指蛋白的基本生物学信息和其细胞穿透特性，并讨论C₂H₂ 锌指蛋白在大分子药物递送中的应用。