拟南芥RabA2b互作蛋白的筛选与鉴定

Rab蛋白家族在调控细胞囊泡的运输过程中发挥着重要作用.拟南芥中存在数量庞大的RabA亚族成员,它们参与调控植物不同阶段的生长发育过程.为了寻找拟南芥RabA亚族下游的调节蛋白或效应蛋白,进而阐明RabA在细胞活动中的角色,本研究选取RabA2b蛋白进行了深入研究.本研究首先构建过表达RabA2b的拟南芥植株,同时结合免疫共沉淀方法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测到多个Hsp70蛋白家族成员与RabA2b蛋白共沉淀.为了进一步研究Hsp70成员与RabA2b的相互关系,将5个细胞质和细胞核定位的Hsp70s蛋白分别构建于植物表达载体,通过在烟草叶表皮细胞中瞬时表达Hsp70s和RabA2b发现它们共定位于细胞质膜、细胞质以及细胞核周围的丝状结构.同时,体外pull-down实验证明了5个Hsp70s蛋白都能与RabA2b蛋白直接相互作用.此外,双分子荧光互补实验(BiFC)进一步证实了Hsp70s与RabA2b在烟草叶表皮细胞中的相互作用,说明拟南芥中细胞质和细胞核定位的Hsp70s可以作为RabA2b的调节蛋白或效应蛋白一同调控植物的生长发育过程.     

COG复合体亚基COG2和COG3之间相互作用的研究

真核细胞内的囊泡运输过程分为四个环节:囊泡的出芽、运输、栓系和融合.这其中的囊泡栓系过程是由栓系因子所介导的.位于高尔基体上的一类栓系因子COG复合体在介导高尔基体内部的囊泡逆向运输过程中发挥着重要的作用.COG复合体由八个亚基组成,本文首先通过基因克隆的方法,克隆获得两个COG亚基COG2和COG3的基因.随后的工作中,通过两种蛋白质之间互作的检测方法,进一步地证明了COG2和COG3两个亚基之间存在着相互作用.     

植物细胞内膜运输调控机制及相关前沿电子显微镜技术应用的研究进展

真核细胞内的蛋白质等生物大分子通常需要借助内膜系统才能被运送到目标部位并发挥相应功能.植物细胞内膜系统由核膜、细胞膜以及多个膜包裹的细胞器组成,包括内质网、高尔基体、反式高尔基体网络、液泡前体/多囊泡体、液泡和自噬体等.植物蛋白质在内膜系统中可以通过囊泡进行运输,对生物个体的生长发育和环境应答至关重要.本文系统地介绍了...     

2013年诺贝尔生理学或医学奖

2013年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，美国、德国3位科学家James E．Rothman．RandyW．Schekman和ThomasC．Sudhof获奖。获奖理由是“发现细胞内的主要运输系统——囊泡运输的调节机制”。     

运动与细胞凋亡

细胞凋亡是细胞按照自身的程序,自己结束其生命的过程。细胞凋亡受细胞内外许多因素的调节,Bcl-2蛋白家族是目前研究得较多的一种。在骨骼肌细胞和心肌细胞内,Bcl-2家族成员之间形成二聚体,调节细胞是否进入凋亡程序。运动量和运动强度对骨骼肌和心肌的细胞凋亡有重要影响。     

Exocyst在极性胞外分泌途径中的作用

胞外分泌是细胞膜物质运输过程中不可或缺的事件,介导细胞内蛋白内含物例如激素和神经传递素的分泌,添加细胞膜蛋白和运输到细胞膜的特定区域。作为细胞生物学进程的基础,胞外分泌对于细胞生长、细胞间交流、细胞极性的建立至关重要。对于大多数真核细胞来说,胞外分泌是极性的。一个名叫Exocyst的多蛋白聚合物在酵母到哺乳动物中的极性胞外分泌中起作用。Exocyst包含八个组分:Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70、Exo84。它们都定位于活跃的胞外分泌位点,为后来的膜融合介导后高尔基体分泌囊泡的定向和栓系。     

小麦(Triticum asetivum L.)杂交种下调表达的GTP结合蛋白基因TaRab的克隆与鉴定

杂种优势的形成与杂种一代中亲本基因的表达方式改变有关.为深入研究小麦杂种优势形成的分子机理,利用通过抑制性差减杂交(SSH)方法获得的小麦Rab类GTP结合蛋白基因片段为探针,筛选普通小麦品系3338三叶期叶片cDNA文库,获得了一个小麦Rab家族基因TaRab.同源性比较和序列分析显示,该基因与拟南芥Rab类GTP结合蛋白基因具有90%氨基酸序列相似性.结构分析表明,它具有GTP结合蛋白4个典型结构以及Rab家族成员特有的YYRGA结构域.半定量RT-PCR表达检测结果显示,TaRab基因在叶片的表达水平要高于其他组织器官.研究还发现,该基因在三叶期、分蘖盛期的根系和叶片中为杂种下调表达.采用电子定位方法,将TaRab基因初步定位在7B染色体的着丝粒区域和C-7DS5-0.36两个区域.在此基础上,对Rab蛋白基因差异表达与杂种优势表现的关系进行了讨论.     

人类ARF1蛋白的重组表达及其与GDP/ADP的弱相互作用

腺苷酸核糖基化因子1(ADP ribosylation factor 1,ARF1)是一种小G蛋白,负责调控细胞内的囊泡运输,从而影响细胞的生长发育.采用分子克隆的方法构建人类ARF1(hARF1)蛋白的重组质粒pET28a-hARF1,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达纯化,随后利用荧光光谱法和分子对接方法研究hARF1蛋白与嘌呤核苷酸(GDP/ADP)之间的弱相互作用.研究结果表明,重组表达的hARF1蛋白分子质量22 859.29u,与理论值基本一致,其纯度大于95%,产率为5mg/L左右;GDP/ADP与hARF1蛋白弱相互作用的结合常数分别为0.022 69和0.007 71(μmol/L)-1,说明hARF1蛋白选择性地结合GDP,这与细胞内hARF1蛋白只结合GDP的结论一致.     

人Rab26基因的克隆和表达

以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET．32a（＋）中,RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异．把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上．在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达．这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础．     

细胞内Ca~(2+)对可释放囊泡库的影响

目的:探讨细胞内Ca~(2+)对可释放囊泡库的影响.方法:取体外培养成熟的新生鼠大脑皮层神经元细胞,分别对正常细胞、去除细胞外Ca~(2+)的细胞、同时去除细胞内外Ca~(2+)的细胞,记录微小型兴奋性突触后电流(mEPSCs)和微小型抑制性突触后电流(mIPSCs),观察兴奋性和抑制性突触可释放囊泡库(RRP)大小,研究细胞外和细胞内Ca~(2+)对细胞胞吐的不同影响.结果:去除神经元细胞外Ca~(2+)和细胞内Ca~(2+)均对mEPSCs和mIPSCs的电流频率有抑制作用,细胞外Ca~(2+)对RRP大小并无显著影响,而去除细胞内Ca~(2+)可引起细胞内RRP的显著降低.结论:细胞内Ca~(2+)可影响RRP的维持.