深红红螺菌draTGB hupL双突变株在不同光照条件下的放氢

为提高深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在两阶段培养条件下的放氢量, 分别构建了缺失吸氢酶大亚基基因hupL的单突变株R. rubrum UR801和缺失固氮酶活性调节因子基因draTGB与hupL的双突变株R. rubrum UR805. 对比测试了这两个突变株与野生型菌株R. rubrum UR2和UR472 (ΔdraTGB)在不同光照条件下的放氢量. 结果表明, 在持续光照条件下, R. rubrum UR801的氢产量最高, 可达5700 mL/L, 分别为R. rubrum UR2, UR472和UR805氢产量的1.56, 2.24和2.32倍; 而在两阶段培养条件下, R. rubrum UR805的氢产量最高, 可达4303 mL/L, 分别为相同条件下R. rubrum UR2, UR801和UR472氢产量的1.35, 1.21和1.04倍. 据此, R. rubrum UR805有望作为两阶段培养条件下大量放氢的菌株.     

磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)氢酶基因功能分析及对细胞生长的影响

探讨了磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)氢代谢与细胞生长、磁小体合成之间的关系. 分别构建了吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株L206和氢酶大亚基基因hyaB与hupL的双缺失突变株B206. 比较了野生型菌株与突变株在摇瓶培养条件下的吸氢量、放氢量、细胞生长曲线和铁的吸收, 并结合电子显微镜观察了细胞内磁小体合成情况. 结果表明, 磁螺菌HupSL为专一性的吸氢酶, HyaAB为专一性的放氢酶; L206在磁小体合成过程中的放氢量相对较高, 其生长速度、铁吸收速度明显快于MSR-1及B206. 推测磁螺菌可通过上述吸氢酶和放氢酶的作用适当调节细胞内还原力的平衡, 促进铁的吸收和磁小体合成.     

产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白α-423~(Ile)位点的突变导致固氮酶催化活性降低

基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论,探索从与P原子簇共价相连的β-93Cys出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点.通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构,利用体外定点突变和基因替代技术,将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)固氮酶β-102Asn,α-431Lys和α-423Ile位点分别替换为β-102Ala,α-431His和α-423Pro,获得Nβ102A,Kα431H和Iα423P突变株.3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响,其中Iα423P突变株几乎无固氮生长,细胞乙炔还原活性显著下降;在42 L发酵罐中培养,其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6;qRT-PCR检测发现此突变株nifD基因4倍的上调表达.分离纯化Iα423P钼铁蛋白,其最高C2H2和H+还原水平分别为野生型的13%和21%.根据以上研究结果推论,突变固氮酶的催化活性显著降低,或与直接打破α-423Ile与高柠檬酸长臂之间的氢键有关,推测α-423Ile是固氮酶催化底物还原过程中,电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸.     

鼓泡式光生物制氢反应器中光合细菌的生长及产氢

提出了一种新型的鼓泡式光生物制氢反应器,并将Rhodopseudomonas palustris CQK-01光合产氢菌在光生物制氢反应器中进行序批式培养,以葡萄糖为碳源底物,以590nm单波长光为光源,研究了不同鼓泡条件下光合细菌的生长、产氢及底物降解特性.实验结果表明,在光生物制氢反应器中适当鼓入氩气气泡可以有效降低反应器内液相氢浓度,减少产物反馈抑制作用,促进产氢性能的提高,并且不同鼓泡频率对光合细菌的生长和产氢有较大影响.实验中间隔3h鼓泡时光合细菌产氢性能最佳,反应器最大产氢量33.25mmol,光能转化效率为18.46%,产氢得率为1.79mol(H2)/mol(glucose),平均底物消耗速率为0.28mmolL-1h-1和平均产氢速率为0.50mmolL-1h-1.     

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) S2中卵磷脂酶的分泌

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2, 通过形态指标、生理生化性状、16S rDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析, 鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes). 采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变, 从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中, 筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808, M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20). 对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明, 丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS, xcpX和xcpW, 它们分别编码XcpS, XcpX和XcpW蛋白, 这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分. 将xcpS, xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上, 通过双亲接合的方式分别导入上述M808, M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验, 结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力. 以上结果表明, 在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的. 解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌, 造成突变株不能降解有机磷. 在解磷能力增强突变株M20中, 被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.     

利用基因工程方法研究生物标志化合物分子来源

利用DNA体外重组技术构建了蓝细菌Synechocystis sp PCC 6803缺失突变株ORF469-,其染色体DNA中与不依赖于光的叶绿素合成途径相关的ORF469片段被红霉素抗性基因所取代. 该突变株细胞内叶绿素的含量完全受培养过程中光的控制. 培养获得的叶绿素含量分别为9.427μg.mg-1和0.695μg.mg-1的两类藻细胞在实验室条件下进行了热模拟降解,分析了热解产物烷烃生物标志物特征,发现两类细胞在类异戊二烯烃的相对含量上差异明显. 低叶绿素含量的蓝藻样品热解产物中Pr/nC17和Ph/nC18值为0.192和0.216,分别是高叶绿素含量蓝藻样品的1/3和1/7. 实验结果为叶绿素分子是植烷和姥鲛烷等类异戊二烯烷烃的分子来源提供了直接的证据,并进一步证实了藻细胞中脂类分子是决定其热解产烃量的主要控制因素. 实验结果表明, 现代分子生物学与有机地球化学的结合可以为某些生物标志化合物的分子来源研究提供新的可行途径.     

共表达1,3-丙二醇氧化还原酶与甲酸脱氢酶对Klebsiella pneumoniae生理代谢的影响

针对1,3-丙二醇发酵过程中中间代谢产物3-羟基丙醛致死性的现象,在野生型的克雷伯氏肺炎杆菌中同时强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶,在增强1,3-丙二醇氧化还原酶酶活的同时,促进NADH的合成,最终降低3-羟基丙醛积累.利用PCR技术分别从克雷伯氏肺炎杆菌和甲醇酵母Candida boidinii基因组中扩增出基因dhaT和fdh,通过表达载体pDK获得1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶共表达的菌株K.p/pTF在IPTG的诱导下,基因工程菌K.p/pTF1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶的酶活分别提高了2.8倍和3.5倍,而NADH含量提高了1.3倍.在有氧条件下批式发酵培养,基因工程菌K.p/pTF可以利用以50g/L的初始甘油为底物正常进行发酵,3-羟基丙醛的最高积累浓度较野生菌降低了50.1%,有效避免了发酵的异常中止.     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.     

Cr介质中生长的棕色固氮菌突变株UW3的固氮酶CrFe蛋白的特性

经DEAE-52, Q-Sepharose和Sephacry S-200柱厌氧层析, 从在含Cr的培养基中生长良好的棕色固氮菌突变株UW3纯化得到CrFe蛋白制备物. 与从野生型固氮菌OP 的MoFe蛋白(OP Av1)相比, 该制备物中~50%的蛋白具有与之相似的亚基组成, 并可与OP Av1的抗体发生免疫交叉反应. 该制备物还具有~40%的OP Av1 C₂H₂, H⁺和N₂ (以在氩气和氮气下放氢的差值表示)还原活性, 并具与OP Av1相似的电子对比率. 金属分析表明, 此蛋白制备物含有Fe, Cr和Mo. 与OP Av1相比, 该制备物在450 nm的圆二色谱 (CD)与之相似, 但在3个相同g值处(g≈4.3, 3.7和2.0)出现的EPR信号相对强度则不相同. 根据EPR计算的结果表明, (ⅰ) CrFe 蛋白制备物的Mo/Cr和Fe/(Cr+Mo)的比率分别为0.4和15.0, 暗示在该制备物中的含Cr蛋白与MoFe蛋白之比约为2.5; (ⅱ) 该制备物活性与Fe及Cr的比率都分别接近于OP Av1活性与Fe和与Mo的比率; (ⅲ) 该制备物的上述3个g处的EPR信号强度与Cr含量的比率分别为Op Av1信号强度与Mo含量之比的~83%, 0%和~40%. 以上结果表明, CrFe蛋白也许是一种新的固氮酶组分Ⅰ蛋白, 除以Cr代替Mo外, 它的功能和包括金属原子簇在内的结构都可能与MoFe相似.     

大豆GmLlsl基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1,Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase,PaO)．为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制,从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因,其cDNA全长1817bp,命名为GmLls1(GenBank登录号：DQ154009)．序列分析表明,该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性,其编码蛋白含有典型的Rieske[2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序,这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征．RT-PCR结果显示,在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中,GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势．进一步分析发现,在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中,GmLls1的表达显著下降,而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中,GmLls1的转录本积累明显增加,暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达,而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论．     

大豆GmLls1基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1, Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase, PaO). 为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制, 从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因, 其cDNA全长1817 bp, 命名为GmLls1 (GenBank登录号: DQ154009). 序列分析表明, 该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性, 其编码蛋白含有典型的Rieske [2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序, 这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征. RT-PCR结果显示, 在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中, GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势. 进一步分析发现, 在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中, GmLls1的表达显著下降, 而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中, GmLls1的转录本积累明显增加, 暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达, 而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论.     

缺失nifZ棕色固氮菌突变株(DJ194)钼铁蛋白的金属原子簇的组成与分布

经DEAE 52, Q-Sepharose和Sephacryl S-200柱的厌氧层析, 从缺失nifZ基因的棕色固氮菌突变株(DJ194)中纯化得到固氮酶钼铁蛋白(ΔnifZ Av1). 厌氧天然电泳后的Western blotting和SDS-变性凝胶电泳显示, ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等与野生种钼铁蛋白(OP Av1)相似; 而且ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号(g ≈ 4.3, 3.65和2.01)及660 nm附近的圆二色摩尔消光系数(Δε)也都与OP Av1较相似, 表明ΔnifZ Av1除具有α₂β₂四聚体结构组成外, 还含有与OP Av1数量相当的、具有3/2自旋态的还原FeMoco. 然而, ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物 (C₂H₂, H⁺和N₂)的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46%~50%, 而反映P-cluster状况的450 nm附近的Δε也明显低于OP Av1, 说明ΔnifZ Av1与OP Av1的差别在于P-cluster, 而不在于FeMoco, 而且是在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少(约50%), 而其组成或氧还状态并未改变. 据此推测ΔnifZ Av1(DJ194)的结构为: 一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster, 而另一个αβ亚基对只含FeMoco, 无P-cluster. 由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中2个P-cluster中的一个不能组装, 因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响并由此提出了NifZ的可能作用机理.