棉花G.LEC1A基因的克隆和鉴定

为了研究棉花LEC1基因的功能,本研究采用同源克隆方法从海岛棉中克隆棉花LEC1基因(G.LEC1A),构建p CAMG.LEC1A植物表达载体,用农杆菌蘸花法转化拟南LEC1缺失突变体lec1-1,通过干燥筛选方法检验LEC1功能恢复情况。结果表明:G.LEC1A基因的ORF全长为627 bp,编码208个氨基酸,具有LEC1蛋白家族保守的B结构域。组成型表达G.LEC1A可恢复拟南芥lec1-1突变体种子的干燥耐受性。研究结果说明,棉花LEC1A基因是拟南芥LEC1的同功基因。     

拟南芥atfes1a突变体种子的热敏感性分析

根据基因芯片数据等生物信息学资料,我们锁定一些未知的且被高温诱导的基因,并获得了一个推测编码蛋白含armadillo/beta-catenin repeat(简称ARM)结构域的突变体salk-021784,该突变体缺失AtFes1A基因,该基因编码一种受高温诱导的ARM 蛋白.利用抗体检测了在拟南芥种子发育过程中AtFes1A的热诱导表达特征, 通过表型分析发现,热处理后的突变体种子萌发率明显低于热处理后的野生型,表明AtFes1A蛋白与拟南芥耐热有关.     

茉莉酸处理对木本油料植物小桐子早期花序芽基因表达的影响

小桐子(Jatropha curcas)是大戟科多年生木本油料植物,其种子含油率较高(30％～40％),是一种潜在的可再生能源植物.然而小桐子雌花较少,种子产量较低,严重限制其推广应用.茉莉酸是一种重要的植物激素,在花发育过程中起着重要作用.为了解茉莉酸在小桐子花发育过程中的作用,应用第二代高通量测序方法,对1.0 mmol/L茉莉酸处理24 h后的小桐子早期花序芽进行转录组测序分析,观测茉莉酸对花发育及相关基因转录的影响.结果显示,外源茉莉酸处理导致早期花序芽中1259个基因上调表达,695个基因下调表达;其中,10个与成花转变相关,8个与花器官发育相关以及18个与茉莉酸合成和信号转导途径相关的拟南芥同源基因表达发生了显著变化,但是花器官表型并未有显著的改变.差异表达基因的GO注释显示,"响应茉莉酸"功能分类基因在上调表达基因群中富集,表明在小桐子中存在可以响应外源茉莉酸处理的信号途径.茉莉酸处理后,与拟南芥花器官发育相关基因同源JcFUL、JcSRS、JcSEP1、JcAGL61、JcWOX1、JcTPR4和JcSEU下调表达,然而小桐子花器官表型没有明显改变,说明在小桐子中这些基因的变化表达不足以改变小桐子花器官表型.实验结果对解析茉莉酸在小桐子花发育调控过程中的作用有一定的参考价值.     

水稻中ACOS5同源基因在小穗中的表达分析

ACOS5是控制拟南芥雄性育的关键基因之一,它也是编码花粉素合成必需的酶.利用氨基酸同源序列分析,在数据库中检索与拟南芥ACOS5同源性较高的植物同源蛋白.将检索出的水稻中同源氨基酸序列与ACOS5进行比对,两者一致性为64%.并且通过同源蛋白系统发生分析,两者在进化上关系也较为密切.根据水稻中同源蛋白基因组序列设计引物,进行低温处理下该基因在小花发育各时期的表达量分析.半定量RT-PCR显示,在水稻小孢子母细胞形成期其表达量较低,而当小孢子开始减数分裂时,表达量急剧增高.在这两个时期,低温(20℃)会诱导OsACOSmRNA积累增加;但当处于小孢子形成阶段时,低温下积累量却呈现相反的降低趋势.这说明环境温度显著影响水稻中ACOS5同源基因的转录表达,而这种影响与小花发育时期有关,提示水稻ACOS基因可能参与环境温度调控水稻雄性育性的过程.     

拟南芥ACOS5基因启动子的克隆和表达载体构建

花药组织特异性启动子在花药发育的分子遗传学中有重要的研究价值.采用PCR方法克隆了1kb长度的ACOS5基因启动子,并将其连入含有GFP基因的拟南芥表达载体p1300中.电激转化农杆菌GV3101后,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因植株.显微观察显示,转基因植物花药只在绒毡层中有荧光表达.这说明ACOS5基因启动子可以在拟南芥花药中驱动外源GFP基因的特异性表达.     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

3个荞麦物种中种子蛋白相关基因的表达分析

以甜荞、苦荞、金荞为研究材料,利用生物信息学在荞麦转录组数据中鉴定种子蛋白相关基因,结果一共鉴定21个种子蛋白相关基因,通过PCR技术可以成功扩增出20个基因,其中包含1个13S球蛋白基因(Unigene.10815),1个11S球蛋白基因(Unigene.34090)和1个谷蛋白基因(Unigene.39749)。利用荧光定量PCR技术鉴定这些基因在甜荞、苦荞和金荞种子发育不同时期的表达情况。结果表明,不同基因在同一材料不同时期的表达情况不同,同一基因在同一时期不同材料中的表达情况也不同。     

FAE1启动子的克隆和转γ-TMT基因大豆的获得

脂肪酸链延长酶组分1(FAE1)是广泛存在于植物中催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,该反应是脂肪酸碳链延长的限速步骤,在油料种子胚中特异性表达.以拟南芥基因组DNA为模板,设计引物,扩增到该基因的启动子片段.序列分析表明,该片段长度为943 bp,与GenBank注册序列AF355982达99.5%同源,并含有与之完全相同的种子特异性表达元件,据此认定它具有种子特异性启动活性.将其与甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因连接,构建成表达载体pFAE1-TMT,通过农杆菌介导的方法转化大豆胚尖,获得28株卡那霉素抗性筛选植株,进一步PCR检测获得2株转γ-TMT基因植株.     

棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因的克隆和功能初步分析

DELLA蛋白是赤霉素信号途径的负调节因子,在棉花纤维发育中有着重要作用。本研究采用同源克隆方法,从棉花中克隆DELLA蛋白Gh GAI2b基因,构建p BP35S:Gh GAI2b和p BP35S:Ghgai2b植物过表达载体,通过农杆菌介导的滴花法转化Col野生型拟南芥。结果表明,棉花DELLA蛋白Gh GAI2b包含了DELLA蛋白家族中所有的典型保守区域;转基因拟南芥表现出莲座叶半径变短,植株矮化,花序紧凑,花器官发育迟缓等生长发育受抑制表型。说明棉花DELLA蛋白Gh GAI2b基因可能参与GA信号途径抑制植物生长发育。     

AtPCS1基因的原核表达及多抗血清的制备

利用RT-PCR扩增拟南芥螯合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列,构建原核表达载体pET28a-AtPCS1并测序.将该载体转化大肠杆菌BL21,用0.75mmol/LIPTG诱导融合蛋白AtPCS1-His的表达,纯化该融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠,ELISA法测定抗血清的效价可达1:2000.抗血清与融合蛋白及拟南芥总蛋白的western-blot结果表明:制备的抗血清具有较高的活性和特异性.     

拟南芥锌指结构域ABRv1基因的功能研究

为了分析拟南芥脱落酸响应蛋白RING-V1基因(ABRv1)的功能,构建了高表达载体pBI121-ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1.通过DNA及RNA水平鉴定了ABRv1基因的T-DNA插入突变体abrv1.对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,突变体的萌发率不足10%,野生型萌发率为40%,而过表达株系萌发率为67%;突变体株系气孔几乎全部关闭,过表达株系气孔关闭不明显,大小是突变体株系的2~3倍.结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用.     

甘薯、番茄和拟南芥中丝氨酸羟甲基转移酶基因家族功能研究

丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase, SHMT)普遍存在于植物中,在高等植物的一碳代谢和光呼吸过程中起着重要作用,然而该家族在甘薯中的功能尚不清楚。文章通过同源比对获取甘薯、番茄、拟南芥中21个SHMT基因家族的信息,通过系统进化树分析,发现21个SHMT蛋白形成4个分支;利用蛋白motif分析、蛋白结构域分析、基因外显子内含子结构分析、蛋白的二级结构和三级结构预测、蛋白质理化性质分析、核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)、亚细胞定位分析预测,发现蛋白高级结构和基因结构在同一分支内更为保守,即同源性越高的蛋白,其结构、性质更为接近。通过对番茄中SHMT基因进行表达量分析,发现SHMT基因可能在番茄种子发育、开花、果实成熟方面发挥作用。另外,通过对拟南芥SHMT(AtSHMT)家族在胁迫条件下的表达水平进行分析,推断多个AtSHMT基因对胁迫尤其是盐胁迫、冷胁迫、热胁迫产生应答,表明SHMT基因家族在胁迫应答中起到调控作用。综上,文章将甘薯、番茄、拟南芥中SHMT基因家族的生物信息学分析及基因表...     

烟草NFL1基因启动子区的克隆和初步的功能分析

植物的开花过程是一个复杂的发育过程,涉及到许多基因的表达和调控,其中LFY同源基因(LFY-like genes)发挥着重要的作用[1～7].在拟南芥中,LFY基因发生突变而失去功能后,花芽分生组织的形成受到显著的抑制[8];将LFY基因在植株中的表达水平提高后则可以有效地促进开花[9].     

甘蓝型油菜BnBRI1基因的克隆及表达分析

以拟南芥油菜素内酯受体BRI1基因序列设计同源简并引物,利用同源克隆技术,克隆了甘蓝型油菜中编码油菜素内酯受体基因全长cDNA序列,命名为BnBRI1(GenBank:JX871217),该基因开放阅读框(ORF)大小为3591bp,与拟南芥中BRI1基因(GenBank:NM_120100)相似性为94.21%,编码1196个氨基酸,与拟南芥中BRI编码的氨基酸相似性为89.23%.采用实时定量PCR分析表明,BnBRI1基因在根、茎、叶中都有表达,但表达量存在显著差异.在两叶一心期和花期的根中表达量最高,四叶一心期和抽薹期的叶中表达量最高.     

利用拟南芥鉴定双孢蘑菇Hsp20和Adcs基因的耐温功能

双孢蘑菇2个差异表达基因热休克蛋白基因(Hsp20)和4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶基因(Adcs)通过根癌农杆菌(Agrobacterium)介导的花序浸渍法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),经草铵磷筛选、聚合酶链式反应(PCR)鉴定和蛋白质印迹(Western blot)鉴定表明,Hsp20基因和Adcs基因已整合到拟南芥基因组中并过表达.对转基因植株和野生型对照进行高温胁迫,比较其耐热性差异.结果显示:经过45℃热激1h处理,Hsp20基因转化拟南芥下胚轴恢复生长,部分幼苗存活;Adcs基因转化拟南芥与野生型一样下胚轴未恢复生长,幼苗基本未存活.实验表明,Hsp20基因对蘑菇的耐热性有直接作用,而Adcs基因对蘑菇的耐热性可能无直接作用.     

过表达OsAIL5基因使水稻种子在发芽过程中对高浓度硝酸盐敏感

从水稻中克隆AP2/EREBP转录因子家族基因OsAIL5(AINTEGUMENTA-like 5),聚类分析结果表明OsAIL5为拟南芥AIL5的同源基因.器官表达谱结果表明OsAIL5在干燥种子中表达量最高.启动子GUS染色分析结果显示OsAIL5在种子发芽后第5～7d表达,并主要定位于根和幼叶中.转35S∷OsAIL5基因水稻的发芽率和生长势指标都表明:过表达OsAIL5基因会导致水稻种子对高浓度硝酸铵敏感.     

桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

为确定桃树细胞质抗寒相关基因,依据模式植物拟南芥中抗寒相关的RBD1基因,结合桃基因组数据设计并克隆到一个桃PpRBD1基因。该基因全长2 230 bp,编码513个氨基酸;结构域分析显示,该氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守结构域,是与拟南芥RBD1同源的蛋白;亚细胞定位预测表明,该基因编码的蛋白可能在叶绿体中表达。该基因可能在桃抵抗寒冷胁迫中发挥重要作用。     

拟南芥AtJ2基因植物超量表达载体的构建

在胁迫条件下,分子伴侣可以稳定蛋白质结构,防止蛋白质凝聚变性,并修复受伤害蛋白.J蛋白是一类重要的分子伴侣.AtJ2是拟南芥(Arabidopsis thaliana)J蛋白中的一种.为研究该基因的功能,提取了拟南芥幼苗的总RNA,经过RT-PCR获得了AtJ2的全长.并将其构建入表达载体pMD中,得到重组质粒pMD/AtJ2.通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将此重组质粒转化入拟南芥,得到了转基因植株,为后续该基因的功能研究奠定基础.     

水稻OsNAP基因的功能分析及其在育种价值方面的研究

NAC转录因子是植物特异的转录因子.本研究通过从水稻日本晴(Oryza sativa L.)的基因组中克隆到一个与拟南芥衰老相关的基因AtNAP(Atlg69490)的同源基因OsNAP.OsNAP的ORF为1 179bp,推测其编码蛋白含有392个氨基酸,等电点为8.55,分子质量为42.195ku.为进一步研究OsNAP的功能,利用显性抑制元件SRDX构建其pCAMBIA1304-35S:OsNAP-SRDX表达载体,通过农杆菌浸染方法将其转化水稻中花11品种.T1代转基因植株通过潮霉素、RealtimePCR、和Western blot鉴定,筛选出4个OsNAP高表达的阳性植株.在种子成熟期,观察到T1代转基因4号植株较野生型相比有明显的延缓衰老的表型,其他农艺性状如单株分蘖数、单株总粒数、单穗饱和穗粒数、千粒重、结实率等都优于野生型.实验证明抑制OsNAP基因的表达能够延缓水稻叶片衰老并可以提高产量,具有潜在的育种价值.     

蝴蝶兰PhAP3基因的表达特性研究

为了探索蝴蝶兰中MADS盒基因在花发育过程中对花器官发育的调控机制,目前从蝴蝶兰中克隆出一个MADS盒基因家族B族基因PhAP3,并对其进行了序列分析和基因表达研究.聚类分析结果表明PhAP3是拟南芥AP3基因的同源基因,但基因表达分析表明PhAP3可以在植物的营养器官和生殖器官中均有表达,这与典型的AP3类基因有所不同.