带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101 BAC克隆的构建及拯救病毒的致病性分析

将整合有禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis, REV)长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒(命名为GX0101)全基因组作为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆进大肠杆菌. BAC载体通过同源重组插入MDV基因组的US2区, 含BAC载体的MDV DNA电转化大肠杆菌菌株DH10B, 鉴定含MDV全基因组的BAC克隆(MDV BAC), 提取BAC DNA, 转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF), 成功拯救出了重组病毒, 命名为bac-GX0101. 将此病毒腹腔接种1日龄鸡, 在攻毒后62 d开始检测到内脏肿瘤, 动物实验结果表明, bac-GX0101毒株与亲本GX0101毒株对机体的致病性等方面的影响没有差异, bac-GX0101毒株仍然保留着很好的免疫抑制功能及致肿瘤能力. 该感染性克隆bac-GX0101为研究该重组野毒株中REV-LTR插入片段及其他基因的生物学功能提供了有用的技术平台.     

又一个例证——SV40 DNA的全核苷酸顺序

病毒SV40以及多瘤病毒作为直核细胞基因结构和表达的模型已被深入研究。 SV40 DNA是一个超螺旋的、环状的双链DNA,它的全核苷酸顺序(5224个碱基对)已发表。全顺序的测出,能够在基因组上确定已知基因的位置。基因组中至少有15.2％是不翻译成多肽的。全顺序可分为早转录区和晚转录区两大区段。早转录区编码两个蛋白质——t抗原和T抗原,二者的基因起始于同一位置,并共用一段约300个碱基对长的片     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA_2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf( )的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。结果表明,中国分离物与日本分离物的REPI片段具极高的序列同源性。将REPI片段克隆到原核高效表达载体pJW2的P_RP_L启动子下游,经温度诱导,获得了高效     

突变酶可抑制爱滋病病毒的生长

目前,人们逐渐认识到酶的作用对人类免疫缺陷综合征病毒(HIV)的复制起着决定性作用。英国WellCOme实验室的研究人员已设法通过替换逆转录酶分子片段上的某些氨基酸的方法,来改变这种酶的活性。逆转录酶在病毒RNA转录成双股DNA过程中起着非常重要的作用,双股DNA可整合于宿主细胞的基因组中。他们认为,如果一些相关酶分子(如逆转录酶)共有一段相似的氨基酸排列,那末,此序列很可能在酶分子的作用中起重要作用。为此,     

三层重迭基因——利用DNA顺序的效率更高

最近,英国剑桥的科学家们又创造了一种新的DNA顺序测定技术,用之于测定大肠杆菌噬菌体G4基因组时,说明病毒基因组为了能将更多的信息压缩在一个小小的DNA分子中,能有些什么新的窍门。 G4是个小病毒,具有与φX174基因组十分相象的单链环状DNA。已经发现,在φX174基因组中有两对重迭的基因。G4 DNA中也存在着这种结构。现在,肖(Show)及其同事又发现G4基因组中还有三层重迭的区域,这个区域在利用DNA顺序方面效     

传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建

通过PCR方法, 删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和 ORF A2非重叠区的33 bp (96~129 bp)的同时, 引入NheⅠ酶切位点(GcTaGc)作为分子标记, 构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3, 与HZ2株B节段真核表达载体pCI-mB在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞. 用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞, 模拟病毒“传代”. 结果表明, 细胞的形态学特征发生变化, 产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应(CPE). 电子显微镜观察显示, 在细胞超薄切片中有IBDV病毒粒子. 间接免疫荧光分析结果表明, 拯救的ANhe3株病毒的结构蛋白在CEF细胞得到了表达, 而非结构蛋白(VP5)则不能表达. 针对A节段的RT-PCR, 酶切鉴定及进一步的序列测定结果验证了相应核苷酸片段的缺失和分子标记的引入. ANhe3株病毒接种不能导致11日龄SPF鸡胚的死亡, 相对HZ2株致死率(20%)明显下降. 本研究利用基于cDNA转染和RNA聚合酶Ⅱ系统的IBDV反向遗传系统, 构建了IBDV VP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株, 为IBDV基因组学的研究提供了新方向, 为进一步探索病毒复制和致病机制以及开发基因缺失疫苗奠定基础.     

中国番茄黄化曲叶病毒小环状DNA分子的发现与证实

番茄黄化曲叶病毒为－Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ联体病毒。在中国番茄黄化曲叶病毒（ＴＹＬＣＶ－ＣＨＩ）中发现并主宰了与ＴＹＬＣＶ－ＣＨＩ有关一些小环状ＤＮＡ分子的存在。这些小环状ＤＮＡ分子的大小为ＴＹＬＣＶ－ＣＨＩＤＮＡＡ全长基因组的一半，１．２～１．４Ｋｂ左右。序列分析表明，这些小分子序列中间均有一段未知来源的ＤＮＡ片段插入。分子杂交证实这些未知来源的ＤＮＡ片段既不与ＤＮＡＡ同源也不与ＤＮＡＢ同源，可     

呼肠孤病毒科斐济病毒属一新种: 南方水稻黑条矮缩病毒

近年在广东省和海南省部分地区新发生一种水稻病毒病, 其症状表现为植株矮缩、叶色深绿、叶背及茎秆出现条状乳白色或深褐色小突起、高位分蘖及茎节部倒生气生须根. 病株韧皮部细胞内可观察到具斐济病毒特征性晶格状排列直径为70~75 nm的球状病毒粒体以及病毒基质和管状结构. 从发病田块及其附近的玉米(Zea mays)、稗草(Echinochloa crusgalli)、水莎草(Juncellus serotinus)和白草(Pennisetum flaccidum)植株体内检测到病原病毒的存在. 田间调查及室内传毒实验表明, 白背飞虱(Sogatella furcifera)是该病毒的主要传毒介体. 该病毒的基因组由10条dsRNA组成, 其电泳图谱与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus)基本相同. 采用接头单引物扩增法获得了该病毒基因组两个片段(S9和S10)全长核苷酸序列, 两者在核苷酸组成、末端序列及基因排列上均具斐济病毒特征, 但与斐济病毒属已知种核苷酸同一率小于75% (S9)和80% (S10), 基于核苷酸及其推导编码产物氨基酸序列构建的系统进化树表明, 该病毒在斐济病毒属中处于相对独立的进化位置. 结果表明, 该病毒应为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组的一个新种, 建议将其命名为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus).     

赛葵黄脉病毒: 一种含有卫星DNA的双生病毒新种

从云南红河地区表现黄脉症状的杂草——赛葵上分离到病毒分离物Y47. 对Y47进行DNA-A的全序列测定, 结果表明, Y47 DNA-A全长2731个核苷酸, 基因组具有典型的双生病毒科病毒特征, 即编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV1(CP)和AV2共2个ORFs, 互补链编码AC1~4共4个ORFs. 对基因组进一步比较发现, Y47 DNA-A与秋葵黄脉花叶病毒分离物201(GenBank登录号: AJ002451)的同源性最高, 达77%, 而与其他双生病毒的同源性均在76%以下, 表明Y47是双生病毒的一个新种, 命名为赛葵黄脉病毒(MYVV). 利用DNAβ的特异性引物beta01和beta02, 从Y47中扩增到卫星DNA分子(Y47β). 序列分析表明, Y47β全长1348个核苷酸, 至少在其互补链上编码一个有功能的ORF(C1). Y47β的全序列与Multan棉花曲叶病毒和Rajasthan棉花曲叶病毒的DNAβ的核苷酸同源性最高, 为62%~67%, 而与其他已报道的DNAβ的同源性均低于46%. 系统关系树分析表明, 卫星DNAβ分子与其辅助病毒是共同进化的.     

呼肠病毒, 在SARS患者中分离与初步鉴定

严重急性呼吸综合征(SARS)疫情在北京造成了严重后果, 冠状病毒已被广泛认定为导致SARS的病原体. 但是临床和实验提示, SARS病因可能不是单一冠状病毒感染. 本文报道了我们从北京市第1例SARS患者和其母亲的咽拭子中分离出呼肠病毒. 在电子显微镜下, 可观察到典型的呼肠病毒. 血清学实验显示, 38例SARS患者中24例对呼肠病毒呈阳性反应. 针对呼肠病毒的基因保守序列(S2基因片段)设计引物, RT-PCR实验扩增出特异性DNA片段. 进一步DNA序列分析表明是一种独特的呼肠病毒(呼肠病毒科正呼肠病毒属). 初步动物实验显示, 该呼肠病毒可导致非典型样肺炎发生和小鼠死亡. 尽管如此, 呼肠病毒感染是否与SARS疫情有关, 还有待进一步研究才能阐明.     

人类巨细胞病毒启动子控制的人Ⅸ因子cDNA在人体细胞中的高效表达

凝血因子Ⅸ(简称Ⅸ因子)是人体内凝系统的重要成分之一,它的缺乏或功能缺陷可导致血友病B.在血友病B基因治疗的研究中,如何提高Ⅸ因子蛋白的产量是关键问题之一。在以前的研究中,我们比较了SV40早期启动子、小鼠金属硫基因蛋白启动子和Moloney小鼠白血病病毒LTR启动子的作用。为进一步提高Ⅸ因子基因在培养细胞特别是人     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

福氏2a志贺氏菌301株基因组水平的缺失基因分析

在完成福氏2a志贺氏菌 301株全基因组序列测定工作的基础上, 以非致病性大肠杆菌K12 MG1655株的全基因组序列为参比对象, 进行比较基因组学分析. 结果显示, 与大肠杆菌基因组相比, 福氏2a志贺氏菌 301株基因组中共有136个长度大于1000 bp的片段缺失, 总长为717253 bp. 这些缺失片段中共包含670个可读框(ORF). 通过对ORFs编码产物的功能预测和分析, 发现这些缺失的ORFs主要编码与细菌代谢相关的酶类、结构蛋白、基因转录调控因子以及与细菌遗传物质水平转移相关的元件. 这不仅从全基因组水平揭示了两种具有不同生物学特性和表型的重要肠道细菌的分子差异, 而且为进一步探索其生理活动过程、致病机制以及肠道细菌间的进化等诸方面的问题提供了有价值的线索.     

Vero细胞培养传代后的2株SARS冠状病毒基因组序列变异分析

RNA病毒在复制时有易出错的倾向, 因此SARS病毒在传染或传代过程中易发生突变而产生不同的毒株, 这种机制也利于病毒逃脱宿主的免疫系统而生存下来. 许多研究也表明, 不同的SARS病毒分离株的全基因组序列存在不同程度的差异, 这些差异的研究无疑对SARS病毒疫苗的研制具有重要的指导意义. 同时, 对SARS病毒在传代过程中的遗传稳定性及核酸特性的分析, 是SARS疫苗研制不可或缺的环节. 采用PCR产物直接测序的方法, 对2株用Vero细胞培养经过多次传代的SARS病毒进行了全基因组序列的测定, 通过比较分析发现该病毒在传代过程中具有高遗传稳定性, 其中检定参比株(Sino1株)2和11代全基因组序列比较有4个碱基的变化, 而候选疫苗株(Sino3株)3与10代的基因组全序列仅有1个碱基的差异. SARS病毒在Vero细胞上传代的遗传稳定性表明, 以此制备的灭活病毒疫苗是稳定的.     

脉冲场凝胶电泳比较大肠杆菌不同品系基因组DNA的SfiI的酶切图谱

肠杆菌科埃希氏杆菌族埃希氏杆菌属的大肠杆菌(Escherichia coli)的四个品系——K-12、B、C和15及它们的衍生菌株基因组DNA经限制性内切酶Sfi Ⅰ酶切后,用脉冲场凝胶电泳技术比较它们的限制性片段的     

鸡痘病毒282 E4株基因组7.3kb Bam HⅠ片段的序列测定与分析

对经亚克隆后的鸡痘病毒(fowlpoxvirus,FPV)282E4株7.3kb BamHⅠ片段 ,用ABI377DNA测序仪荧光标记法进行了序列测定 ,并应用DNAsis软件同GenBank中已知的FPV序列和痘苗病毒 (vacciniavirus,VV)Copenhagen株的全序列进行了同源性比较 ,发现与鸡痘病毒MunichHP 438株11.2kbBamHⅠ片段的序列同源 .此外 ,对所测序列的开放读码框架 (openreadingframes,ORFs)所编码的氨基酸序列同上述VV株中所有ORF的氨基酸序列进行了同源性比较 ,并对各ORF编码蛋白的信号肽、跨膜区的存在与否进行了分析.     

基于二次打断IPed DNA片段ChIP-Seq的模拟分析

ChIP-Seq是在全基因组水平上研究活体细胞中蛋白质和DNA相互作用谱的有效手段.近年来,随着高通量短序列DNA测序技术的快速发展,研究基于新一代DNA测序方法的ChIP-Seq分析算法已经成为热点之一.然而,目前报道的分析方法主要是基于对免疫共沉淀获得的DNA片段进行片段大小选择后的ChIP-Seq数据,也就是主要针对Solexa系统获得的数据进行分析的算法.SOLiD系统是目前测序通量最高的新一代DNA测序系统.在SOLiD系统的DNA测序文库制备过程中,采用对免疫共沉淀获得的DNA片段进行二次超声打断可以满足ePCR对序列长度的要求,因此SOLiD测序文库中的DNA测序片段较短.到目前为止,基于SOLiD系统测序特点的ChIP-Seq研究很少报道.本文旨在研究测序文库中DNA片段的长度对ChIP-Seq分析的影响.通过真实的ChIP-seq数据和模拟产生的ChIP-Seq数据,对目前3种主要的ChIP-Seq分析方法(CisGenome,SISSRs以及MACS)的特点进行研究.有报道表明来自Solexa系统的ChIP-Seq数据局部有明显的正负链双峰特征,而通过对真实的来自SOLiD系统的ChIP-Seq数据特征的挖掘,我们发现单个峰局部无明显的正负链双峰特征,并且峰的局部的序列分布大部分符合正态分布.基于这些特征,我们模拟了两个不同测序平台的ChIP-Seq实验.在控制了模拟实验的可比性后,我们发现当前基于Solexa文库制备方案的ChIP-Seq数据发展的算法,并不能有效地捕获来自SOLiD系统的ChIP-Seq数据特征.我们的研究还表明,误用ChIP-seq软件可能是导致部分SOLiD的ChIP-seq实验失败的原因.因此,需要开发一种新的基于二次打断IPedDNA片段的ChIP-Seq分析策略.     

CpG DNA增强口蹄疫病毒DNA疫苗诱发豚鼠产生的免疫应答

CpG DNA是一些具有免疫刺激作用的核苷酸序列，这些序列在DNA疫苗诱发机体产生的免疫应答中起着重要作用。设计并化学合成了一段含CpG DNA的寡核苷酸，将其插入编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶及O型口蹄疫病毒抗原表位融合蛋白的表达质粒中，并观察了其对重组质粒介导的免疫应答的影响。结果显示，插入的寡核苷酸能增强重组质粒诱发豚鼠产生的病毒中和抗体及T细胞增殖反应，并能提高豚鼠的抗病毒感染能力，证明将CpG DNA克隆进DNA疫苗中提高DNA疫苗免疫活性的一条有效途径。同时，构建的DNA疫苗为抗口蹄疫DNA疫羁的应用奠定了一定的基础。     

冠状病毒

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus).新发现的SARS病毒属冠状病毒的一个新种.科学家对SARS病毒基因组进行了全面测序分析后发现,其基因组由29730个碱基组成,与已知的三类冠状病毒相差甚远,只有64%的序列相同.可以推测,SARS病毒不是已知病毒的近期变种,而是一种新的冠状病毒.     

1970~2004年全球肠道病毒71型分离株的分子流行病学分析

人类肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病的主要病原体，常导致严重的神经综合症。近年来病毒多爆发于亚太地区的热带区域。为了研究人类肠道病毒的进化历程以及遗传变异性，我们搜集了全球在1970年至2004年间分离的532株病毒的序列信息，这些信息包含了完整或接近完整的VP1片段序列(全为891个氨基酸)。经过两两序列比对以及遗传距离的分析，发现绝大多数病毒株属于先前分类的B或C型。同时，也观察到一种特殊的不属于任何分型的毒株R13223-IND-01，可能代表了一种新的病毒分型。在B型和C型病毒中，存在着一些区别于同型其他亚型的“孤儿株”，它们的出现在病毒进化分析中有重要的意义。此外，VP1片段上有6个位于离散位置的氨基酸存在共变异的现象，分析发现这种高比例的共变异与病毒亚型有着紧密的联系。