人类肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位

蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式．甲硫氨酸（Ｍｅｔ）被氧化则变为甲硫氨酸亚砜（Ｍｅｔ（Ｏ）），它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失，但肽－甲硫氨酸亚砚还原酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ， ｍｓｒＡ）则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，使其所在蛋白质重新恢复活性．为了研究人体中Ｍｅｔ氧化还原的机制，以牛ｍｓｒＡ ｃＤＮＡ序列为信息探针，筛选人ＥＳＴ数据库，依据若干同源ＥＳＴ的信息从人ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个长１２５５ｈｐ的人ＭＳＲＡ ｃＤＮＡ．该ＣＤＮＡ包含一个长７０５ ｂｐ的可读框，它编码了 ２３５个氨基酸残基．同源性比较表明，该基因与牛和大肠杆菌的ｍｓｒＡ基因的氨基酸一致性分别为８８％和６１％．表达谱分析发现，该基因在人体大多数组织中均有一条长约１．６ｋｂ的转录本，并在肾中呈高表达．应用辐射杂种细胞株定位系统（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ， ＲＨ ｍａｐｐｉｎｇ）将该基因精确定位在人染色体８ｐ２２～２３区带的ＤＳＳ５１８和Ｄ８５５５０位标之间，由于此前已有Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃｗｉｎｔｅｒｅｒｙｔｈ     

人神经元电压门控钙通道γ-3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析，得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在 ４３５ ｂｐ中有 ７５％同源的 ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｗ２９０９５）．在该 ＥＳＴ中设计引物与 ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ反应，在人脑前叶皮质 ｃＤＮＡ文库和人脑 Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得 ｃＤＮＡ序列 １５４５ ｂｐ，其中包含一个 ９４８ ｂｐ的可读框，编码 ３１５个氨基酸．该可读框经确证命名为 ＣＡＣＮＧ３．ＣＡＣＮＧ３基因与大规模测序中定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１的ＢＡＣ克隆ＡＣ００４１２５完全一致，从而将该基因定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１，并由此获得它的基因组结构，编码区由４个外显子组成．经ＲＴ－ＰＣＲ分析，ＣＡＣＮＧ３在成人脑和胎脑有表达．运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ在视网膜色素变性家系、视网膜色素变性伴耳聋和癫痫家系进行突变检测，未检测到突变．     

MBLL cDNA的克隆及组织表达分析

果蝇的ｍｂｌ基因编码一个核蛋白，含有２个Ｃｙｓ３Ｈｉｓ锌指基序。ｍｂｌ基因的突变将影响果蝇所有光感受器细胞的分化。根据与ｍｂｌ基因高度同源的人ＥＳＴ ＡＡ０８６１３９设计ＰＣＲ引物，筛选胎儿脑ｃＤＮＡ点阵文库，得到一个人ｃＤＮＡ，命名为ＭＢＬＬ。     

CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的仰制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子（ＣⅡＴＡ）对人类白细胞抗原（ＨＬＡ）Ⅱ类分子表达的影响，用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到Ｃ Ⅱ ＴＡ基因ｃＤＮＡ ５＇端片段，构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体 ｐｃＤＮＡ－Ⅱ，基因转移 ＨＬＡ Ⅱ类分子诱导型表达的 ＨｅＬａ细胞．经 ＩＦＮ－γ诱导，发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降，而 ＨＬＡⅠ类分子的表达不受影响．实验证明 ＣⅡ ＴＡ反义 ＲＮＡ对 ＨＬＡ Ⅱ类分子表达具有显著的抑制作用，为进一步开展低免疫原性的细胞移植提供了依据．     

CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的抑制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子对人类白细胞抗原Ⅱ类分子表达的影响，用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到ＣⅡＴＡ基因ｃＤＮＡ５’端片段，构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体ｐｃＤＮＡ－Ⅱ，基因转移ＨＬＡⅡ类分子诱导型表达的ＨｅＬａ细胞，ＩＦＮ－γ诱导，发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降，而ＨＬＡ Ｉ类分子的表达不受影响。实验     

转基因马铃薯中病原诱导GO基因的表达及其对晚疫病的抗性

利用ＰＣＲ技术从黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中扩增并克隆了葡萄糖氧化酶（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ，简称ＧＯ）基因，并将马铃薯病原诱导型启动子（Ｐｒｐ１－１基因启动子）与其融合构建了植物表达载体ｐＣＡＭＧＯ。经农杆菌介导转化获得了转基因植株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示葡萄糖氧化酶基因整合进马铃薯基因组。该基因的表达及所引起的Ｈ２Ｏ２的生成由淀粉－ＫＩ的显色反应得到证实。用马铃薯晚     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母DMC1基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的减数分裂特异基因，其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的，根据在酵母Dmc1与拟南芥AtDmcl中保守的氨基酸motifs合成的简并性引物，以cDNA作模板，通过套式PCR（nested PCR）和RACEs克隆了水稻中酵母DMC1的同源基因OsDMC1，OsDMC1全长的cDNA是1348bp，编码344个氨基酸组成的多肽（OsDmcl），OsDmcl与Dmcl和AtDmcl的氨基酸序列一致性分别是51．8％和81．7％，OsMDC1在生殖器官中表达量较高，在根中有少量表达，而在叶和幼芽中不表达，Southern blot分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。     

耐旱植物厚叶旋蒴苣苔BDN1脱水素基因的克隆及表达特性分析

根据已知植物脱水素基因保守区域设计引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ方法从耐旱植物厚叶旋蒴苣苔的总ｃＤＮＡ中扩增出一个５００ｂｐ的与植物脱水素基因同源的序列。结合５’ＲＡＣＥ获得了植物脱水素基因家族一个新成员ＢＤＮ１的全长ｃＤＮＡ（１１４８ｂｐ）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明，ＢＤＮ１基因在厚叶旋蒴苣苔基因组中以单拷贝形式存在，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明，该基因的表达受干旱，寒冷及ＡＢＡ的诱导。推测该基因与     

小鼠胸腺上皮细胞株MTEC1表达的化学趋化因子的类型分析

以自行设计的引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法从小鼠胸腺上皮细胞株ＭＴＥＣ１的总ＲＮＡ中扩增出了ＳＤＦ－１α，ＩＰ－同和Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ等６种化学趋化因子的ｃＤＮＡ片段，对扩增片段进行了酸测序鉴定，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析结果显示；ＳＤＦ－１ｍＲＮＡ在ＭＴＥＣ１细胞株中存在两种不同的剪切形式，ＭＴＥＣ１的浓缩培养上清对小鼠胸腺ＣＤ＾４－ＣＤ＾８Ｔ细胞具有中等强度的趋化活性，符合ＳＤＦ－１的生物学功能。     

通过构建嵌合分子研究mEAAC1和mASCT1的底物结合区域

采用重组ＰＣＲ的方法,构建了小鼠兴奋性氨基酸转运蛋白家族２种亚型ｍＥＡＡＣ１和ｍＡＳＣＴ１的ｃＤＮＡ嵌合分子,通过体外转录成ｃＲＮＡ,显微注射亚洲爪蟾卵母细胞中外源表达后,用同位素示踪技术进行＾３－Ｇ和＾３Ｈ－Ｓｅｒ流量测定,结果表明,该２种转运蛋白的－ＮＨ２末端及其相邻的部分可能不含有决定底物特异性的氨基酸,它们也许仅对底物结合位点的形成起结构支持作用。     

Pfu酶基因的克隆、表达、纯化及长距离PCR的研究

用ＰＣＲ方法从Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ的总ＮＤＡ扩增出了含有Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌＡ基因的２．３ｋｂ片段,并将该基因克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。用ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ对重组质粒ｐＴ－ｐｆｕ进行了酶切。并将ｐｆｕ ｐｏｌＡ基因捶 入表达载体ｐＥＴ－３ｄ－Ｘ。     

水稻抗病基因同源序列的克隆、定位及其表达

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物，从抗稻瘟病水稻品种种窄叶青８号第１链ｃＤＮＡ和基因组ＤＮＡ中扩增出３个与植物抗病基因同源的序列：Ｏｓｒ１，Ｏｓｒ２和Ｏｓｒ３，三者核苷酸水平的同源性在９８％以上。     

人神经元电压门控钙通道 γ -3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析，得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在４３５ｂｐ中有７５％同源的ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｗ２９０９５）。在该ＥＳＴ中设计引物与ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式ＰＣＲ和ＲＡＣＥ反应，在人脑前叶皮质ｃＤＮＡ文库和人脑Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得ｃＤＮＡ序列１５４５ｂｐ，其中包含一个９４８ｂｐ的可读框，编码３１５个氨基酸。该可读框经确证命名为ＣＡＣＮＧ３     

一种新的小鼠被毛突变基因定位

分别尝试用ＲＡＰＤ（随机扩增多态ＤＮＡ）法和重组率测定法对所发现的被毛突变进行基因定位。结果为所选用的１００个１０ｂｐＲＡＰＤ引物中,８７个获得了扩增产物,由于所获得的产物与小鼠表现间缺乏相关性,利用ＲＡＰＤ法未能交闰到染色体上。以分布于小鼠１１条染色休下的Ｉｄｈ１,Ｃａｒ２,Ｍｕｐ１,Ｐｇｍ１,Ｈｂｂ,Ｅｓ１０,Ｅｓ１,Ｍｏｄ１,Ｇｄｃ１,Ｃｅ２,Ｅｓ３等生化基因位点为遗传标记,对分别对与ＣＡＢ     

稻瘟病病原物诱导启动子的构建及表达

利用ＰＣＲ技术从小麦和马铃薯中分别扩增并克隆了病原诱导性谷胱甘肽－Ｓ－转移酶基因ＧｓｔＡｌ和Ｇｓｔｌ启动子片段，将它们分别与水稻肌动蛋白基因（Ａｃｔｌ）核心启动子序列、５’端非翻译前导序列以及ＧＵＳ基因融合构建出植物载体ｐＷＭＩＧ－５０和ｐＰＭＩＧ－５０，然后转化水稻，并对嵌合启动子的诱导活性进行了分析。结果表明：（１）在转基因水稻细胞中嵌合启动子可受稻瘟病病原物的诱导；（２）水稻Ａｃｔｌ第一内含     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨 ＣＤ２分子的信号传递功能，以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈｒ２１１－Ｇ１ｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”，采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ｃＤＮＡ序列．并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内与ＣＤ２胞内区结合的特异性．克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胞内蛋白分子，与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－１）同源 Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体转运蛋白质．蛋白数据库检索表明，Ｆｔｅ－１具有蛋白激酶ＰＫＣ的结合与作用位点，提示Ｆｔｅ－１参与ＣＤ２分子介导的信号传递     

棉纤维相关cDNA的克隆及其在4个纤维突变体中的结构变异

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从陆地棉遗传标准系“ＴＭ－１”的纤维细胞ＲＮＡ中克隆了一种纤维细胞优势表达的ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ，记为ＴＭ－Ｅ６基因），该基因不含内含子，可读框长为７７１ｂｐ，可编码２４６个氨基酸的多肽。从４个纤维突变体中分别克隆同源性基因，并与野生型“ＴＭ－１”的ＴＭ－Ｅ６基因进行了同源性分析，发现纤维突变体不但在基因结构而且在密码组成上有明显变异。在距转录起始位点的第２７９碱基对处有ＧＧＣＴＣ     

天然雌核发育银鲫与两性生殖彩鲫卵母细胞中蛋白激酶基因表达差异的比较

采用ｍＲＮＡ差异显示方法，以蛋白激酶基因家族保守区的设计５′引物，比较天然雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫母卵细胞中蛋白激酶基因的表达，结果表明，以引物Ｔ１２ＭＡ，Ｔ１２ＭＣ和Ｔ１２ＭＧ合成的ｃＤＮＡ第１链分别再经蛋白激酶特异引物扩增所得到的ＰＣＲ条带数目和分布模式各不相同，从胶上总共回收并克隆了２１个ｃＤＮＡ片段，对其中３个做了Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交验证，有２个在彩鲫卵母细胞中特异表达，另１个在银鲫中特     

钙调神经磷酸酶催化结构域的活性和性质

钙调神经磷酸酶（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，ＣＮ）是唯一的Ｃａ＾２＋／钙调素（Ｃａｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）信赖的蛋白磷酸酶，由催化亚基Ａ（ＣＮＡ，６１ｋｕ）和调节亚基Ｂ（ＣＮＢ，１９ｋｕ）１：１组成。用ＰＣＲ方法构建了仅含ＣＮＡ催化结构域的编码区ｃＤＮＡ序列。经在Ｅ．ｃｏｌｉ中诱导表达，纯化，制备了ＣＮＡ催化结构域多肽。以ＰＮＰＰ为底物，研究了其磷酸酶活力。结果表明，在有ＣａＭ和ＣＮＢ时，其活性为ＣＮ     

人类细胞因子信号传导抑制因子基因humSOCS-2的分离与克隆

采用国际ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ数据库同源筛选的策略,筛选到１个与小鼠细胞因子信号传导抑制因子基因ｍｍＳＯＣＳ－２高度同源的ＥＳＴ９ｇｂＡＡ１１５２３９）,在人胎盘ｃＤＮＡ分子库中步移获得一长１０１１ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,包含一个长５９４ｂｐ的开放阅读框,编码了１９８个氨基酸残基,经ＮＣＢＩ数据库检索是一个全新的基因。