锚定PCR(Anchored PCR): 一种新的染色体步行方法

基于PCR的技术是克隆已知DNA片段侧翼序列的最常用方法．到目前为止，这些方法大致可以分为3种类型：反向PCR(inverse PCR)、连接介导的PCR(1igation-mediated PCR)和随机引物PCR(randomly primed PCR)．反向PCR是使用最早的方法，其原理是用限制性内切酶消化基因组总     

显微分离黄鳝单条染色体用于基因定位

在倒置显微镜下显微分离了黄鳝56条单染色体，以兼并寡核苷酸为引物进行PCR扩增，并将其DOP－PCR产物作为探针进行染色体反向描绘，描绘结果表明，已对黄鳝1，3，5，6，7，10和12号染色体获得了成功的分离。随后，把这些染色体DNA的DOP－PCR产物列阵点于尼龙膜上，作为“特定染色体DNA池”（specifical chromosomal DNA pool0用于黄鳝基因定位，定位结果显示：Zfα基因位于1号染色体，rDNA基因位于3号和7号染色体，GH和PDEGγ基因位于10号染色体，HSL基因位于5号染色体，并在1，3，6和10号染色体上同时检测到Hox基因杂交信号，据此还初步推测了部分保守同线群，为鱼类基因定位和杂色体进化研究提供了一种新的可行方法，也为鱼类核型研究中以分子标记确认每条染色体提供了新思路。     

一种从特殊植物材料中制备PCR模板的新方法

报道了一种从较长年代的植物标本以及富含次生代谢物质的植物材料中制备PCR模板的新方法，对常规方法提取的纯度较低的总DNA，采用微量玻璃粉吸附，并直接用于PCR反应，作为应用实例，比较了新方法与常规方法对6个样品的nrDNAITS区和cp DNArbcL基因的PCR扩增结果，结果显示，新方法明显比常规方法优越，这为特殊植物材料DNA的纯化与PCR模板的制备提供了一种简便、快速、低成本的方法。     

番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的分离及其内含子功能

应用PCR技术，从番茄中分离了具有一个内含子的蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的核基因。该内含子序列（TPI）的长度为109bp，两端存在着典型的GT／AG双核苷酸结构，其AT碱基对的含量非常高，约占核苷酸对总数的80．7％。DNA重组实验表明，TPI序列能够有效地促进报告基因gusA的表达水平，而且这种促进作用与该序列的插入位置及方向均无关系，呈现出明显的增强子特性。另外，GUS酶组织化学染色、荧光检测以及凝胶阻滞等实验等均证明TPI序列可能还具有启动子的活性，番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的核基因序列在GenBank中的登记号为AY007240.     

小麦抗条锈病基因Yr10的AFLP标记

以抗条锈病基因Yr10的供体亲本Moro作参照，用6个Pst I端引物和10个Taq 1端引物对抗条锈病基因Yr10的近等基因系和轮回亲本Avocet S进行了AFLP分析，共扩增出约4200条可分辨的带，其中5条为稳定的差异带，用Yr10基因的供体亲本Moro和感病品种铭贤169要交产生的F2代分离群体，对5个特异条带与目的基因的遗传连锁性进行了初步分析，发现特异条带TP0502与Yr10基因连锁，将该片段进行克隆，测序，根据其序列设计了PCR特异扩增用专化引物，经用195株F2代分离株进行遗传连锁性分析表明，用所设计的引物进行PCR，其主要产物SC200片段与抗条锈病基因Yr10的连锁距离为0．5cM，可用于该基因的快速，有效，准确检测。     

基因组中双重位点特异性重组体系的建立及应用

应用重组ＤＮＡ技术，将ＦＲＴ－ＦＲＴ和ＬｏｘＰ－ＬｏｘＰ两套重组酶特异的识别位点构建在一个名为Ｃ４ＬＦＹ的载体中，并依次在载体中构建了Ｐ因子、果蝇ｙｅｌｌｏｗ基因的两个外显子和一个内含子、顺式作用元件（启动子和增强子）和侧翼区ＤＮＡ，组成了双重位点特异性重组体系。通过转基因技术将该体系整合到果蝇基因组中，再分别与特异的ＦＬＰ和Ｃｒｅ重组酶相互作用后，成功地在基因组同一位点上完成了ＦＬＰ／ＦＲＴ和Ｃ     

Pfu酶基因的克隆、表达、纯化及长距离PCR的研究

用ＰＣＲ方法从Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ的总ＮＤＡ扩增出了含有Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌＡ基因的２．３ｋｂ片段,并将该基因克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。用ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ对重组质粒ｐＴ－ｐｆｕ进行了酶切。并将ｐｆｕ ｐｏｌＡ基因捶 入表达载体ｐＥＴ－３ｄ－Ｘ。     

转芪合酶基因植物中三羟基反式芪的功能

应用RT－PCR方法，从葡萄组织中克隆了两个芪合酶基因的编码区（1．19kb)。在大肠杆菌中能特异表达42ku的蛋白质，其分子量与芪合酶大小一致，并用其制备了兔抗血清。利用pBin438构建了植物组成型表达载体，经农杆菌介导获得转基因烟草植株。PCR，Southern blot,Western blot和RT－PCR分析证明该基因已整合到烟草的染色体中，并正常转录和特异表达。薄层层析和HPLC的结果进一步判断表达的芪合酶在烟草中可催化其底物合成3，4′，5－三羟基反式芪（trans-resveratrol),从转基因烟草中纯化的3，4′，5－三羟基反式芪能使人乳腺癌细胞停留在Go,G1期的细胞数增加。     

嗜盐菌XZ515 中类BR 蛋白基因部分片段的序列研究

在一个新嗜盐菌Ｈ．ｓｐ．ＸＺ５１５吧，编码自螺旋Ｃ至螺旋Ｇ的视黄醛蛋白基因片段已扩增并测定了此基因片段的核苷酸序列，翻译出的氨基酸排列次序与菌紫质蛋白和ａｒ－１，ａｒ－２相应蛋白的相应片段进行了比较，结果说明，在ｂｒ蛋白中，对于完成质子泵功能和视黄酝酿结合为关键性的氨基酸残基均为保守的。在ｂｒ蛋白中，Ｍ１４５可能对于视黄醛异构化反应是重要的残基。     

双拷贝v-cath基因的重组AcMNPV的构建与功能

利用AcMNPV穿梭载体Bac-to-Bac系统构建了分别由标状病毒极早期基因iel启动子和极晚期基因ph启动子控制的AcMNPV组织蛋白酶基因v-cath表达的两种双拷贝重组杆状病毒。用这两种重组病毒感染细胞主 幼虫，研究了不同时相v-cath基因的表达及细胞和幼虫死亡的机理。SDS－PAGE和Western blot分析结果表明：在感染Sf9细胞12h后（12hpi)，重组病毒dciAcMNPV的晚期基因v-cath在早期基因iel启动了驱动下得到表达。到48hpi，重组病毒dcdAcMNPV中v-cath基因在晚期和极晚期ph启动子驱动下高水平表达，阴性对照v-cath缺陷型病毒（ncAcMNPV)则没有V－CATH蛋白表达。毒力实验表明它们的杀虫活性大小依次为dcdAcMNPV＞dciAcMNPV＞野生型AcMNPV＞ncAcMNPV。根据双拷贝重组病毒的毒力和幼虫的死亡特性，AcMNPV的v-cath基因是一个毒力辅助因子和与虫体液化死亡有关的基因。所构建的重组病毒dcdAcMNPV由于是通过改变病毒自身基因的表达时相和拷贝数而提高了杀虫效率，因而不存在田间释放时的安全性隐患，有望成为一种新型的病毒杀虫剂。     

一种新的特异性DNA放大技术—PCR

多聚酶催化的链反应(PCR)是一种在体外将特异性DNA进行引物介导的酶促放大方法。该方法的建立是分子生物学研究中的一大突破。它有许多优点,并有广阔的应用前景。《一种新的特异性DNA放大技术——PCR》对此种方法的原理、操作和应用作了介绍,可供有兴趣的读者参考。     

水稻OsEBP-89基因部分转录本中第1内含子的滞留

OsEBP-89基因是水稻中一个转录因子编码基因。该基因含有两个内含子，采用RT－PCR和Southern杂交等方法的检测结果表明，在OsEBP-89基因的部分转录本中，115bp长的第1内含子未被剪接。从水稻cDNA文库也筛选到了仍然保护有第1内含子的OsEBP-89基因的cDNA克隆。OsEBP-89基因第1内含子不完全剪接的转录本与正常成熟转录本的比例在水稻不同组织中是不同的。这是真核基因中内含子滞留的一个新的例子。     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建

为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）的稳定高效表达，在建立７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３原生质体转化条件的基础上，构建了含６００ｂｐ不完整ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）结构基因片段的插入型同源重组质粒ｐＸＷ，并通过同源重组模式整合到Ｍ１０３３的染色体上，实现了ＧＩ基因的破坏（ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ），获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株。对同源重组片段的分     

用多聚酶链式反应快速检测转化细胞中外源人凝血因子重Ⅸ cDNA

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用人工合成的寡聚核苷酸引物和DNA多聚酶进行体外DNA扩增,这是近年迅速发展起来的分子生物学技术。这一技术已在基因诊断、突变检测、多态性研究和核苷酸顺序分析等方面得到应用。在基因转移和基因治疗中,常常有必要对转化细胞进行DNA分析,检测区分外源DNA和基因组DNA。常规用的方法不仅需要大量细胞,而且需要同位素标记的探针和Southern杂交,整个过程既麻烦又费时。本文介绍我们用PCR技术,对转有外源基因——人凝血因子IX cDNA的血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞和其他转化细胞进行的直接检测和DNA分析。     

基于多功能纳米磁珠的DNA制备与基因分型

为了构建DNA样品制备芯片, 研发了一种以羧基修饰的磁性纳米粒子作为固相载体, 从全血、唾液和细菌培养基中快速提取基因组DNA并扩增靶基因的通用方法. 这种羧基修饰磁性纳米粒子不但可以从样品中富集靶细胞和从细胞裂解液中吸附DNA, 而且吸附在纳米磁珠表面的DNA可以不用洗脱而直接作为目标基因PCR扩增的模板, 从而通过功能集成简化了从靶细胞富集到靶基因扩增的全过程. 利用该方法实现了微量唾液样品中HLA基因的快速制备与扩增, 扩增产物与固定于寡核苷酸基因芯片上的16条探针杂交进行HLA基因分型, 取得了良好的效果. 由于该方法快速简便, 不使用有毒试剂和离心操作, 便于用以构建快速高通量的核酸制备微芯片.     

油菜Polima和陕2A细胞质雄性不育系相关基因的序列比较

orf224是在油菜Polima胞质中发现的一个与细胞雄性不育相关的线粒体基因，陕2A不育系则是我国第一个大面积推广的杂交油菜品种“秦油2号”的亲三，Polima和陕2A的基因组DNA为模板，通过合成5′和3′端一对待异引物，利用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR）从两个不育系的基因组DNA中都扩增出了与orf224同源的DNA片段，将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行序列测定，测序结果表明：两序列均由675个核苷酸组成，编码224个氨基酸组成的多肽，两序列的核苷酸及推导出的氨基酸同源性分别为99．9％和99．6％，在＋398处两者有一个碱基的差异（AAC→AGC）和一个氨基酸的差异（Asn→Ser），从而证实了Polima和陕2A为线粒体上同一座位的不同等位基因的差异。     

普通小麦中来自黑麦的抗白粉病Pm20基因的抗谱分析和AFLP定位

用24个在我国具有代表性的小麦白粉菌已知毒性菌株,对两个不同来源的小麦-黑麦6BS_6RL易位系进行了抗病性鉴定,表明Pm20基因已发生抗谱分化.以这两个材料为亲本配制TAM104R×TAM104S杂交组合获得F2分离群体,对亲本和F2分离群体进行AFLP分析.亲本DNA经PstⅠ/TaqⅠ双酶切消化,并接上各自的接头,然后以其接头为基础加1个或3个碱基,分别经过两次PCR扩增.结果16对PstⅠ/TaqⅠ引物组合(4个PstⅠ引物,4个TaqⅠ引物)PCR扩增出2290条带,共获得3个与该基因连锁的分子标记,分别位于Pm20基因的一端2.6和11.6cM,另一端3.6cM处,实现了对Pm20基因的连锁分析.     

我国大豆主产区黑龙江省田间种植大豆的转基因成分检测

采集黑龙江省不同地区田间210份大豆检测样品, 利用定性PCR技术分析检测其中是否含有转基因成分(CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS基因). 结果表明, 210份样品中均未检测到CaMV35S启动子成分; 在13个样品中虽扩增出类似CP4-EPSPS的条带, 但对PCR产物的进一步酶切鉴定表明, 所有扩增结果为假阳性. 利用巢式PCR对样品0x1的进一步分析表明, 该样品中不含有转基因大豆(roundup ready)成分. 对0x1样品用CP4-EPSPS引物扩增得到的片段进行了测序. 序列分析表明, 该片段与CP4-EPSPS基因的同源性仅有81%, 再次证明它不是转基因大豆的CP4-EPSPS基因.     

王百合单染色体DNA文库的构建

以王百合为模式植物建立了简单快速分离植物单染色体及扩增和克隆其DNA的方法 ,即显微操作分离单个染色体并放入Eppendorf管中 ,经Sau 3A酶切后在染色体DNA片段两端加上Sau 3A寡核苷酸人工接头 ,然后以寡核苷酸人工接头中的一条链为引物进行两轮PCR扩增 .PCR产物为 30 0～ 2 50 0bp ,多数为10 0 0bp左右 ,经Southern杂交证实PCR产物来自王百合基因组DNA .对单染色体第二轮PCR产物进行克隆 ,构建单染色体DNA文库 ,得到约 10 0 0 0 0个重组子 .对其中 84个重组子进行分析 ,插入片段为 30 0～180 0bp ,平均为 780bp .与以往方法相比 ,此方法避免了在纳升体积内酶解、连接等操作 ,扩增底物只需一条染色体而不是以往的几十条 ,而且克隆片段 (平均 780bp)大于以往的报道 (平均 6 50bp) .