腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不N时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达,结果发现,GFP基因在Adv-GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达,本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不同时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达．结果发现,GFP基因在Adv．GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达．本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

MDV中meq基因对CEF细胞chTERT,chTR表达影响的研究

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR方法检测了MDV中meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT)、端粒酶RNA亚基(chTR)表达水平的影响,并用TRAP法测定了端粒酶活性,用流式细胞仪检测了细胞周期的变化.实验结果表明,转染48 h后chTERT表达水平为转染后72 h的16倍,chTR表达水平在转染前后基本不变;转染48 h后CEF细胞的相对端粒酶活性是转染72 h后的12倍;在转染后72 h S期细胞的百分比较未转染细胞显著增加.     

Elafin重组腺病毒载体在气道上皮细胞中表达的时相性变化研究

为研究elafin重组腺病毒表达载体Ad～elafin转染气道上皮细胞的特性，探讨其在上皮细胞中表达的时相性变化，运用①应用原代培养技术培养人气道上皮细胞；②Ad—elafin表达载体转染气道上皮细胞；③在转染后不同的时相中，采用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达，ELISA法单克隆抗体检测细胞上清液elafin蛋白的表达，Northern膜杂交检测elafin基因mRNA的表达量等方法进行研究．发现：①原代培养人气道上皮细胞约5d即可作为靶细胞。②转染Ad—elafin24h时，荧光显微镜下可见上皮细胞内有少量的GFP表达，随着时间的延长，细胞内荧光逐渐增加，96h时GFP荧光阳性的细胞约为80％。③转染24～96h，实验组细胞上清液elafin的含量高于对照组（p〈0．01）；同时elafinmRNA的水平高于对照组（P〈0．05，0．01），且elafin表达及elafinmRNA水平在一定时间内呈时间依赖性关系。结论：Elafin重组腺病毒表达载体Ad—elafin成功转染人气道上皮细胞，目的基因不仅能在上皮细胞中表达，而且elafin蛋白具有细胞外分泌作用．     

RNAiFect~(TM)和SuperFect转染试剂对4种细胞活性的影响

在RNA干涉中,转染试剂的用量与siRNAs的量成正相关关系,但因转染试剂对细胞有一定的毒性作用,超过一定用量可以引起细胞形状改变、脱落、甚至死亡,直接影响着干涉的效率,所以确定转染试剂的优化用量,是RNA干涉试验中的重要环节.将不同用量的RNA iFectTM和SuperFect两种转染试剂分别加入鸡胚成纤维(CEF)细胞、293细胞、PK细胞和MDCK细胞中,在4h和24h后观察细胞的活力情况,比较了不同转染试剂对不同细胞的影响.结果表明:相同用量的两种转染试剂对293细胞、PK细胞和MDCK细胞的生长的影响远远小于对CEF细胞的影响;两种转染试剂用于外源小分子转染时,建议在293细胞、PK细胞和MDCK细胞上的用量不超过3u l;两种转染试剂对CEF细胞的毒性较大,不适合用于转染.     

禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.     

抗白血病转移药物筛选模型的实验研究

构建抗白血病转移药物筛选模型.K562细胞转染GFP质粒后,经筛选,将稳定高表达GFP的K562细胞注射到鸡胚里,孵化后观察K562细胞在鸡胚中转移情况.在其脑部、胸骨及心脏可看到明显的荧光,最频繁发生的部位是脑部.成功构建含GFP的白血病鸡胚模型,并验证了虎眼万年青皂甙（OSW-1）和链激酶（SK）联合用药的抗转移效果.     

NDV-Lasota毒株在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性

为探讨NDV-Lasota株在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的增殖特性,采用细胞病变观察、空斑技术、红细胞吸附试验和血凝试验等方法对Lasota株在CEF上的感染特性及其增殖动力学进行检测。结果表明:NDV-Lasota株在添加外源性胰蛋白酶的条件下,可在CEF上有效复制,细胞维持液中胰蛋白酶浓度为25μg/mL时,病毒感染细胞24 h后,红细胞吸附试验呈阳性;30 h后培养上清液血凝效价大于22;48 h后出现明显的细胞病变;72 h后细胞单层上形成边界清晰、圆形的小空斑。     

TGFβ1shRNA靶向抑制离体胎鼠肺成纤维细胞TGFfβ1基因表达

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对离体胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗提供技术基础和依据.方法:原代培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型.针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1shRNA绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空白组为对照,通过JetPEI包裹分别转染上述高氧损伤的胎鼠肺成纤维细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用实时荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:①成功培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型;②荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TG-Fβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1 mRNA表达量,转染后24、48和72 hTGFβ1shRNA质粒组TGFβ1 mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.3%、96.9%和71.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染胎鼠肺成纤维细胞后24、48和72 h均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

利用体细胞核移植技术生产黄牛和水牛同种、异种转基因克隆囊胚

以含neo和GFP基因双标记的水牛、黄牛胎儿成纤维细胞进行牛转基因体细胞核移植,结果发现：阿菲迪霉素可有效将胎儿成纤维细胞同步于G0／G1期;以GFP阳性细胞进行核移植,其卵裂率、囊胚率与对照组间无显著差异（P〉0．05）,所构建的重组胚,2-细胞阶段观察不到GFP的表达,4-细胞以后GFP的表达逐渐增强,在囊胚的内细胞团和滋养层细胞均可检测到GFP的表达,将黄牛同种转基因克隆囊胚进行移植,获得1例妊娠;黄牛卵母细胞-水牛供核细胞构建异种重组胚囊胚率显著高于黄牛供核细胞-水牛卵母细胞构建的异种重组胚（P〈0．05）,并且异种核移植重组胚中可检测到GFP表达,GFP可作为异种核移植胚胎来源的一种新标记．