同源于hMIP-1α的vMIPα对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4^ 白细胞膜上的趋化因子受体为共受体，与此共受体结合的趋化因子类似物可阻HIV进入靶细胞。实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）同源的人疱疹病毒8K6基因编码产物vMIPα是否具有结合人趋化因子受体的功能。首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPα与人趋化因子的结构异同，用PCR扩增出K6片段，克隆于哺乳类细胞表达载体，转染于NIH3T3细胞，得到条件培养液。然后将K6基因在大肠杆菌中表达，得表达产vMIPα。结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPα单一分子量的mRNA，此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPα可与人趋化因子^125I-hMIP-1α竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体，而且此条件培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应。研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应。研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5结合但不引起细胞黏附反应，即封闭HIV的CCR5共受体，提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性。     

同源于hMIP-1α的vMIPα对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPα是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPα与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPα. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPα单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPα可与人趋化因子125I-hMIP-1α竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.     

HIV-1跨膜蛋白gp41的生物学功能——潜在的gp41细胞受体的研究

几年来 ,HIV 1跨膜蛋白 gp41的生物学功能研究又取得了重大进展 .几个研究小组提供的实验证据证实gp41有一个潜在的细胞受体 .一个重组的gp41胞外区多肽 (aa5 39～ 6 84)以及gp41的免疫抑制多肽 (aa5 83～ 5 99)能够连接人B淋巴细胞和单核细胞 ,仅能较弱的连接T淋巴细胞 .我们发现gp41有 2个细胞结合位点 (aa5 83～ 5 99和aa6 4 1～ 6 75 ) .gp41能够选择性地抑制人T ,B淋巴细胞和单核细胞的增殖 ,选择性地增强人MHCⅠ和Ⅱ类分子以及ICAM Ⅰ分子在细胞表面的表达 .针对第一结合位点的单克隆抗体和 gp41结合蛋白能抑制这种调节作用 .gp41和Ⅰ型干扰素之间存在氨基酸序列的同源性 ,同源区正位于gp41的第一结合位点和Ⅰ型干扰素的受体结合位点 .一些研究结果表明 ,gp41的 2个结合位点与HIV病毒感染细胞相关联 .含有 2个结合位点的多肽分别能够抑制HIV病毒感染细胞 .一个识别第二位点的单抗能广泛中和HIV_1的实验室病毒株和最新分离的病毒株 .此外 ,针对猴免疫缺陷病毒 (SIV)跨膜蛋白 gp32分子上 2个同源区的抗体能保护猴免受SIV的感染 .这些研究结果提示 :gp41细胞结合位点和细胞受体的研究定会对HIV病毒感染机理的研究和疫苗以及抗感染药物的研制产生重大影响 .     

一种新型多肽类HIV-1进入抑制剂

近年来，阻止HIV-1进入宿主细胞已经成为研究和开发新型抗HIV-1药物的热点。我们根据HIV-1表面膜蛋白gp120与受体CD4以及中和抗体17b的共结晶结构，设计了一系列17b的多肽类似物。采用固相多肽合成技术合成多肽P20，并检测了P20对于HIV-1进入人外周血单核细胞的影响。实验证明P20能够有效抑制以CCR5为辅助受体的HIV-1进入人外周血单核细胞，对以CXCR4为辅助受体的HIV-1并没有明显抑制作用。由此可以推断，P20可以特异性的与HIV-1表面膜蛋白结合，阻断HIV-1与辅助受体CCR5的结合，从而抑制HIV-1的进入。该分子为开发新型抗HIV-1药物提供了有效的先导物。     

非病毒基因载体介导短发夹RNA转染抑制肿瘤细胞生长

利用肿瘤细胞表面抗原G250的单克隆抗体G250mAb和聚乙二醇(PEG)修饰非病毒基因载体聚乙烯亚胺(PEI), 获得肿瘤靶向基因载体G250mAb-PEI-PEG. 该载体对HeLa细胞的基因转染效率达到70%, 远远高于对非肿瘤细胞NIH3T3 30%的转染效率. 通过该基因载体将Nucleostemin(NS)基因的特异性短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)高效率地转入靶细胞HeLa, RNA干扰下调了细胞中NS的表达, 显著抑制了HeLa细胞的增殖能力, 引起HeLa细胞凋亡, 而对NIH 3T3细胞的增殖和活性没有显著影响. 研究结果表明, 非病毒基因载体G250mAb-PEI-PEG可靶向性、高效率的转染HeLa细胞, 应用于基因治疗, 这对于宫颈癌的临床治疗具有重要的意义.     

genistein抑制人TNF-α诱导的猪内皮细胞对人单核细胞和自然杀伤细胞的黏附

研究了蛋白质酪氨酸磷酸化在hTNF-α诱导猪主动脉内皮细胞(PAEC)黏附分子E-选择素(E-selectin)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达以及在增强人外周血单核细胞(PBMo)和自然杀伤细胞(PBNK)黏附中的作用. 以选择性的蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)抑制剂genistein预处理PAEC, 剂量依赖性地抑制了hTNF-α增强的PAEC对PBMo和PBNK的黏附. 这种抑制作用发生在hTNF-α激活PAEC的早期, 并且具有可恢复性. PTKs活性测定表明genistein剂量也依赖性地抑制了hTNF-α对PAEC的PTKs的激活. 流式细胞术PAEC表型分析指出genistein抑制了hTNF-α诱导的E-selectin和VCAM-1的表达. 这些结果表明PTKs可以调节hTNF-α诱导的PAEC黏附分子E-selectin和VCAM-1的表达, 以及hTNF-α增强PBMo和PBNK的黏附, 而饮食来源的genistein可能会作为一种黏附拮抗剂在控制这种细胞介导的排斥应答中发挥作用.     

genistein抑制人TNF-诱导的猪内皮细胞对人单核细胞和自然杀伤细胞的黏附

研究了蛋白质酪氨酸磷酸化在hTNF-α诱导猪主动脉内皮细胞(PAEC)黏附分子E-选择素(E-selectin)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达以及在增强人外周血单核细胞(PBMo)和自然杀伤细胞(PBNK)黏附中的作用.以选择性的蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)抑制剂genistein预处理PAEC,剂量依赖性地抑制了hTNF-α增强的PAEC对PBMo和PBNK的黏附.这种抑制作用发生在hTNF-α活PAEC的早期,并且具有可恢复性.PTKs活性测定表明genistein剂量也依赖性地抑制了hTNF-α对PAEC的PTKs的激活.流式细胞术PAEC表型分析指出genistein抑制了hTNF-α诱导的E-selectin和VCAM-1的表达.这些结果表明PTKs可以调节hTNF-α诱导的PAEC黏附分子E-selectin和VCAM-1的表达,以及hTNF-α增强PBMo和PBNK的黏附,而饮食来源的genistein可能会作为一种黏附拮抗剂在控制这种细胞介导的排斥应答中发挥作用.     

宿主遗传多态性与HIV/AIDS感染和进展的关系

人体对HIV-1的易感性, 除病毒本身和个体的行为因素外, 宿主的遗传因素, 即遗传变异起了重要作用. 一些个体的不感染和长期不进展现象完全是由于宿主本身的遗传背景造成的, 而非药物. 在过去的10年中, 有关宿主的遗传多态性与HIV感染、AIDS病程进展、抗HIV药物治疗效果和毒性的研究已成为HIV研究的热点. 宿主的遗传因素主要通过作用于病毒入侵细胞形成感染这一过程和修饰机体的免疫反应而影响对HIV的易感性和AIDS病程的进展. 这些遗传变异主要包括细胞因子受体和配体系统基因及HLA和抗原呈递系统基因. 前者有CCR5, CCR2, SDF1, IL10, RANTES, IFN-γ和CXCR6等. 后者包括HLA-B*57, HLA-B*27和HLA-B*35等. 其中CCR5和CCR2的变异是研究得最透彻的. CCR5基因编码区32个碱基的纯合性缺失 (CCR5Δ32) 可完全保护携带者不感染HIV, 杂合性缺失可延迟感染后病程的进展; CCR5Δ32还有利于抗病毒治疗. 对宿主遗传背景的的研究不仅可以理解HIV的自然感染过程, 对病情的预测、抗HIV药物的开发、治疗策略的制定及疫苗研究都有指导意义. 目前CD4阳性T细胞计数、HIV病毒载量、CD4阳性T细胞耗竭速度及AIDS临床症状是临床上判断病情的依据, 而没有考虑可能起重要作用的宿主因素. 最近的研究表明, HIV抑制因子CCL3L1 (MIP-1αP) 基因的拷贝数与个体HIV-1/AIDS的易感性相关. 拥有的CCL3L1拷贝数越少, 对HIV-1越易感. 每多一个拷贝就可降低4.5%~10.5% HIV感染的风险. 这使得通过筛查CCL3L1剂量, 结合其他宿主基因分型如CCR5, 预测个体对HIV/AIDA的易感程度、指导临床治疗成为真正的可能.     

巨噬细胞及其表达和分泌产物在类风湿性关节炎发病中的作用

巨噬细胞分化自外周血单核细胞,二者在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）的发病过程中起着关键性的作用。这些细胞参与了炎症的启动和维持、白细胞的黏附和迁移、基质的降解和血管新生。巨噬细胞表达黏附分子、趋化因子受体（chemokine receptor,CR）和其他表面抗原;它们还分泌趋化因子、细胞因子、生长因子、蛋白酶和其他介质。这些炎症介质是关节炎中炎症和血管新生发生的重要病理机制。近年来,巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）受到研究者们的广泛关注,这种细胞因子可由包括巨噬细胞在内的多种细胞产生,它反过来可以促进巨噬细胞的活化和细胞因子的产生;同时,它可以调节机体对糖皮质激素的敏感性;并且将类风湿性关节炎与动脉粥样硬化等炎症疾病联系在一起。在类风湿性关节炎发病过程中,巨噬细胞还可以产生多种蛋白酶（如组织蛋白酶G,cathepsin G）,这些蛋白酶促进了炎症和血管新生的发生。鉴于巨噬细胞及其表达和分泌产物在类风湿关节炎致病机理中具有关键性作用,它们已成为治疗类风湿性关节炎的一个理想靶点。     

经ibeB基因转染的鼠胚胎干细胞分化的研究

ibeB是一个致脑膜炎大肠杆菌K1株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经ibeB基因稳定转染的鼠胚胎干细胞能特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin. GFP标记的活细胞观察显示外源性IbeB蛋白定位于细胞核. 上述结果提示ibeB基因可能在调控nestin表达过程中发挥功能, 这为研究nestin基因的表达调控提供了资料.     

膜结合型巨噬细胞集落刺激因子的受体作用

根据细胞因子的定义 ,信息应由因子流向受体 ,可溶性受体与膜结合因子结合可有信息反向传导 .人白血病细胞系J6_1细胞表面同时存在膜结合型M_CSF及其受体 ,构成自家并置性刺激 .将由J6_1细胞膜分离的M_CSF可溶性受体加入J6_1细胞培养观察到细胞增殖受抑制 ,分裂指数降低 ,细胞直径增大 ,多核细胞比例减少和多种细胞表面抗原表达的下调 .J6_1细胞在可溶性受体作用数分钟至 2 0min可观察到细胞内pH的明显变化 ,表明有信号通过m_M_CSF传入细胞 ,这种信号传入不受m_M_CSF糖基化影响     

膜结合型巨噬细胞集落刺激因子的受体作用

根据细胞因子的定义 ,信息应由因子流向受体 ,可溶性受体与膜结合因子结合可有信息反向传导 .人白血病细胞系J6-1细胞表面同时存在膜结合型M-CSF及其受体 ,构成自家并置性刺激 .将由J6-1细胞膜分离的M_CSF可溶性受体加入J6-1细胞培养观察到细胞增殖受抑制 ,分裂指数降低 ,细胞直径增大 ,多核细胞比例减少和多种细胞表面抗原表达的下调 .J6_1细胞在可溶性受体作用数分钟至20min可观察到细胞内pH的明显变化,表明有信号通过m-M-CSF传入细胞,这种信号传入不受m-M-CSF糖基化影响     

genistein抑制人TNF-α诱导的猪内皮细胞对人单核细胞和自然杀伤细胞的黏附

研究了蛋白质酷氨酸磷酸化在ｈＴＮＦ－α诱导猪主动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）黏附分子Ｅ－选择素（Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ）和血管细胞黏附分子－１（ＶＣＡＭ－１）表达以及在增强人外周血单核细胞（ＰＢＭｏ）和自然杀伤细胞（ＰＢＮＫ）黏附中的作用，以选择性的蛋白质酷氨酸激酶（ＰＴＫｓ）抑制剂ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ预处理ＰＡＥＣ，剂量依赖性也抑制了ｈＴＮＦ－α增强的ＰＡＥＣ对ＰＢＭｏ和ＰＢＮＫ的黏附。这种抑制作用发生在     

致肾盂肾炎大肠埃希菌对不同细胞感染能力的比较

致肾盂肾炎大肠埃希菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)与尿路上皮细胞之间的相互作用对阐明泌尿道感染的发病机制具有重要意义.本研究利用UPEC132感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人肾癌细胞(Ketr-3细胞)和膀胱癌细胞(EJ细胞),比较细菌对3种细胞的黏附和侵袭能力.结果表明,UPEC132对上述3种细胞均能黏附与侵袭,其黏附率分别为(49.20±7.55)%,(55.22±4.09)%和(73.20±5.26)%,侵袭指数分别为(2.61±0.32)×10-3,(3.00±0.34)×10-3和(3.25±0.20)×10-3.UPEC132对EJ细胞的黏附率高于另外2种细胞(P<0.05),对EJ细胞的侵袭指数与Ketr-3细胞无显著性差异(P>0.05),但高于Vero细胞(P<0.05).用间接免疫荧光法检测细胞表面P血型抗原物质,表明3种细胞均存在P菌毛受体,以EJ细胞表面的受体分布最多.激光共聚焦显微镜可直接观察到表达绿色荧光蛋白的UPEC132/pSELECT-GFP对EJ细胞的侵袭.由于UPEC132对EJ细胞的黏附能力最强,并直接证明具有侵袭性,...     

不同构象状态HIV-1 gp120分子运动特征及构象转换能力研究

人类免疫缺陷病毒HIV-1包被蛋白gp120通过与宿主细胞表面受体CD4和辅助受体CCR5/CXCR4发生相互作用而侵染细胞. CD4结合状态的HIV-1 gp120核心与CD4结合前状态的SIV gp120核心结构已经被X射线晶体衍射技术所测定. 但是, 静态的晶体结构不足以阐明gp120动态结构特征及其构象转化能力. 用同源模建技术构建不同功能状态的gp120结构模型并用CONCOORD模拟方法生成它们的结构装配体, 最后利用本质动力学算法提取、分析前4个本征向量所描述的分子运动特征. 结果表明, gp120的主要运动模式表现为内部结构域、外部结构域、桥片层以及V3环之间的旋转/扭曲、绕曲/关闭、延长/压缩运动或这些运动方式的组合, 这些运动模式与受体结合以及HIV-1病毒免疫耐受性有关. 进一步利用本质亚空间重叠算法评估gp120不同构象间的相互转换能力, 结果表明, CD4结合前状态(unliganded) gp120向复合物状态(CD4-complexed)转化的能力强于向移除CD4复合物状态(CD4-free)转化的能力, 而CD4-free gp120比CD4-complexed gp120具有更强的向结合前状态转化的能力. 本研究揭示了gp120动态结构与功能的关系, 并为抗HIV药物设计提供了参考和帮助.     

人外周血白细胞对糖皮质激素反应性的昼夜节律

我们曾报告,人外周血白细胞的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)有昼夜节律,在该文中对GR的昼夜节律可能伴有靶细胞对糖皮质激素(glucocorticoid,GC)反应性的昼夜节律的问题做了推测性的讨论。本文以氢化可的松(hydrocottisone,F)对白细胞趋化性运动(chemotactic migration,ChtM)的抑制为指标,证明了白细胞对GC的反应性同样呈现出昼夜节律性的波动。     

SARS相关病毒与鼠肝炎病毒S蛋白的同源暗示一个潜在受体结合区的存在

最近, 一种新的冠状病毒被确定为近期爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体. 虽然人们对人冠状病毒229E已经有了较多的研究, 而且其受体结合位点也被确定在S蛋白第417~547个氨基酸残基之间. 但是, 这一区域与新分离的SARS相关病毒(香港株, CUHK-W1)没有任何同源性. 有意思的是, 已知的各种冠状病毒S蛋白S1亚基的序列比对和进化分析显示, 鼠肝炎病毒(MHV)与SARS相关病毒的同源性最高. 而且, MHV的S蛋白上负责受体结合的重要位点(第62~65和第214~216位氨基酸残基)与SARS相关病毒的相应区域(第51~54和第195~197位氨基酸残基)高度同源. 这些生物信息学的分析结果可能对研究SARS相关病毒的受体结合位点和病毒侵染靶细胞的机理有所帮助, 进而为设计抗病毒药物和疫苗提供新靶点.     

埃可病毒11型利用双受体CD55和FcRn侵染细胞的分子结构基础

埃可病毒11型属于小RNA病毒科,肠道病毒属,是B族肠道病毒中的一个重要血清型.埃可病毒11型可导致儿童和青少年脑炎和脑膜炎等疾病,在婴儿和新生儿中导致重症感染甚至致命的病例也时有报道.此外,埃可病毒11型还多次在新生儿和婴幼儿群体中引起暴发性感染,如2019年中国广东省发生的院内感染暴发事件,造成了19例新生儿的感染和5例死亡,严重威胁人类健康和公共卫生安全. CD55是20世纪90年代初发现的部分埃可病毒的吸附受体,该受体可以帮助病毒吸附在细胞表面,但并不能介导病毒完成完整的入侵过程.我们在2019年的研究中,发现了人新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor, FcRn)是B族肠道病毒的通用脱衣壳受体,并以埃可病毒6型为例解析了病毒入侵机制.本研究利用冷冻电子显微镜技术,解析了埃可病毒11型在入侵过程中不同pH条件下各阶段的病毒颗粒结构,以及病毒与两受体的复合物,共10个原子或近原子水平高分辨率冷冻电子显微镜结构,并结合表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)和脂质体模拟试验等分子水平试验,系统地阐述了埃可病毒11型利用CD55和FcRn"双受体系统"入侵细胞的分子机制.埃可病毒11型利用其VP2、VP3结构域与吸附受体CD55的3、4两个短同源重复(short consensus repeat, SCR)结构域结合,结合后病毒颗粒不发生变构.病毒与脱衣壳受体Fc Rn结合之后,开始发生变构,并可在脂质体膜的辅助作用下释放遗传物质完成脱衣壳.与埃可病毒6型不同的是,埃可病毒11型结合FcRn之后在中性条件下即可起始变构.本项研究解析了重要病原埃可病毒11型侵染细胞的分子结构基础,并进一步完善了非囊膜病毒的"双受体"入侵模型.     

Nelin的肌动蛋白结合特性及与其相互作用

为了研究人新基因nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的生物特性, 并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质, 对Nelin蛋白的全长及其部分结构域进行了肌动蛋白结合共沉淀实验, 并在真核细胞内进行了免疫荧光共定位实验. 结果发现, 在体外共沉淀和细胞内共定位实验中Nelin均表现出同肌动蛋白相结合的能力. 进一步采用酵母双杂交的方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选, 得到了3个阳性克隆分别为细丝蛋白(Filamin)C亚型、肌联蛋白(Titin)N2B亚型和a胰蛋白酶抑制物重链前体 (ITIH). 通过免疫共沉淀实验, 验证了Nelin能够同Filamin的羧基末端免疫球蛋白样结构发生相互作用. 通过上述实验证明了Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白, 并且能够同Filamin相结合. 由此推论新基因nelin的心肌表达产物Nelin是一个细胞骨架相关蛋白并且很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白, 起到了参与细胞黏着斑形成的过程.     

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.