环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片段的研究

用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌（Ｅａｃｉｌｌｕａｅｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２）基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达（卡那霉素抗性高达１２００μｇ／ｍＬ）．当用限制酶ＸｂａⅠ去除其５′－端１．２ｋｂ片段（命名为Ｘｂ片段）后，３′－端片段仍能启动Ｋａｎ￣ｒ基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ但当１．２ｋｂ片段反向插回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ．将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ￣ｒ基因启动子的上游时，卡那霉素抗性由２００μｇ／ｍＬ上升至１０００μｇ／ｍＬ．当Ｘｂ片段反向插入时，Ｋａｎ￣ｒ基因的表达却明显受到抑制，降为１００μｇ／ｍＬ．这说明Ｘｂ片段具有正向增强而反向衰减Ｋａｎ￣ｒ基因表达的能力．用ＢＣ６片段的两个亚克隆片段与ｃ－２菌株总ＤＮＡ分别作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交时，结果显示３′－端片段以单拷贝形式存在于基因组中，而Ｘｂ片段则以多拷贝形式散布其中．由此推断Ｘｂ片段并非一定伴随该基因启动子存在．     

在大肠杆菌中直接克隆白腐丝状真菌-黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子

利用启动子探钍型载体ｐＳＵＰＶ４ 直接在大肠杆菌细胞中克隆到多个来自白腐丝状真菌－黄孢平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ）的基因启动子片段．这些基因启动子片段能在大肠杆菌细胞中启动重组卡那霉素抗性基因（ｒｋａｎｒ）的表达,不同片段赋予宿主细胞以不同的卡那霉素抗性水平,最高的可达１０００μｇ／ｍ Ｌ,最低的则为５０μｇ／ｍ Ｌ．琼脂糖凝胶电泳显示这些重组质粒ＤＮＡ 中均有不同大小的插入片段,其范围是０．５～６．０ｋｂ．选取一个插入３．９ｋｂ 的重组质粒ｐＰＣ３３ 所作的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交结果表明,插入片段以单拷贝形式存在于Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ 的基因组中．当此片段５′－端被除去１．８ｋｂ 后,余下的２．１ｋｂ 片段可使融合的Ｋａｎｒ 基因的表达效率提高６０％ ．     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片…

用大肠杆菌启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达。当用限制酶ＸｂａＩ去除其５’－端１．２ｋｂ片段后，３’－端片段仍能启动Ｋａｎ’基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ，但当１．２ｋｂ片段反向回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ。将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ’ａｄｌｄ     

环状芽胞杆菌基因启动子的分离与鉴定

环状芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ酶切后插入到启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１的ＢａｍＨＩ位点，转化大肠杆菌后，在卡那霉素的平板上筛选到５０个抗性菌落。从随机挑取的２９个抗住菌落所分离到的质粒ＤＮＡ经限制酶切和琼脂糖凝胶电泳后表明，各质粒均有ＤＮＡ插入片段，对２９个样品进行卡那霉素抗性试验显示，抗性最高的可超过１０００μｇ／ｍＬ这表明来自环状芽胞杆菌的某些基因启动子能在大肠杆菌中十分有效地启动基因表达，选取两个最大的克隆ＤＮＡ片段ＢＣ３和ＢＣ６作为探针与Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２．总ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，均获得杂交带。斑点杂交结果表明，这两个ＤＮＡ片段来自不同的基因启动子。对ＢＣ６和ＢＣ３分别进行了限制酶谱分析，并绘制了限制酶图。     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

甘薯（Ipomoea batatas L.Lam.）基因启动子在根癌农杆菌中 …

作者曾用自行构建的启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４,从甘薯总ＤＮＡ中克隆到了６５个在大肠杆菌中具有启动基因表达功能的ＤＮＡ片段,现研究发现,甘薯基因启动子片段在根癌农杆菌中也具有启动基因转录的功能,其启动功能的大小与启动子片段在大肠杆菌中启动卡那霉素抗性基因表达活性呈正相关,即原来卡那霉素抗性越高的,ＧＵＳ基因的酶活性越高。利用重组子ｐＩＢ２中插入片段所做的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验证实,该ＤＮＡ片段来     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

中国Btken-Ag cry1Ac杀虫毒素基因核心片段的克隆及核苷酸序列测定

用ＰＣＲ方法,将苏芸金芽孢杆菌肯尼亚亚种Ａｇ菌体（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｋｅｎｙａｅ Ａｇ,简称Ｂｔｋｅｎ－Ａｇ）编码ｃｒｙ１Ａｃ杀虫毒素蛋白的Ｎ末端（１．８４ｋｂ）的基因片段扩增后,淫ＥｃｏＲⅠ消化成三个不同大小的片段,将原扩增片段及酶切片段分别连接到ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ克隆载体后转化进大肠杆菌,将每一克隆片段进行序列测定,在此基础上又设计出特异引物,再次以ｃｒｙ１Ａｃ的     

用Ti质粒的双元载体法将抗性基因转入西红柿体细胞

采用Ｔｉ质粒的双元载体法对西红柿（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）的叶片外植体进行遗传转化，经选择培养基的筛选，从抗性愈伤组织细胞中诱导出具有卡那霉素抗性的幼苗．分子杂交证实，卡那霉素抗性基因通过根瘤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）的介导，整合到细胞核基因组中，转化子具有较高的新霉素磷酸转移酶活性，说明抗性基因在受体细胞得到表达．     

一种新的植物生长抑制剂生物活性鉴定法

报告一种新的植物生长抑制剂生物活性鉴定法一油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ）下胚轴试法，该试法以浸渍法处理吸涨２ｈ的油菜种子，２６℃黑暗保温５３ｈ后测定结果，以１０μｇ／ｍｌ的检测浓度可将１０种已知抑制剂的活性准确多分开来。检测ＡＢＡ、Ｓ０７和Ｓ０８的线性浓度范围均为０．００１～１μｇ／ｍＬ，ＰＰ３３３为０．１～１μｇ／ｍＬ。它与某些经典试法的反应灵敏度相当或更高，且更加简便快速。     

林可链霉菌噬菌体φSL60启动子的克隆与鉴定

以启动子探针质粒ｐＩＪ４８６为载体,变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２３作受体,克隆了林可链霉菌噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ上的启动子活性片段。以ｐＵＣ１８为载体构建ＳＬ６０ＤＮＡ之ＫｐｎＩ片段的基因文库,从中筛选出两个片段,分别克隆于ｐＩＪ４８６中获得ｐＵＩＳ２９和ｐＵＩＳ１９８,在ＭＭ培养基上,两者的转化子对卡那霉素的抗性均仅为１０ｍｇ／Ｌ。噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ的ＢｇｌＩ片段直接克隆入ｐＩＪ４８６的ＢａｍＨＩ位点,获得重组质粒ｐＭＭＳ１,其转化子的卡那霉素抗性在ＭＭ培养基上可达２５０ｍｇ／Ｌ。分析表明ｐＭＭＳ１上的插入片段约为９２０ｂｐ,含有一个ＳｓｔＩ位点,四个ＭｂｏＩ位点。该片段用ＭｂｏＩ部分酶解缩小到６００ｂｐ,亚克隆入ｐＩＪ４８６中得到重组质粒ｐＭＳＢ１４,其转化子对卡那酶素的抗性水平提高到３００ｍｇ／Ｌ。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,ｐＭＳＢ１４中的ｎｅｏ基因可以表达出氨基糖苷磷酸转移酶（ＡＰＨＩ蛋白）。这些结果表明ｐＭＳＢ１４中的插入片段可能具有较强的启动子活性。     

多能硫杆菌RubisCO基因的亚克隆及各种启动子对其表达的影响

将多能硫杆菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｕｓｖｅｒｓｕｔｕｓ）ＲｕｂｉｓＣＯ基因从两个方向亚克隆到ｐＢＲ３２２和ｐＫＫ２２３－３载体上,通过酶切的方法对各种质粒的插入方向进行了确证．并进一步对这两种插入方向的质粒在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中的表达情况进行了酶活性的测定,该基因片段在ｐＫＫ２２３－３载体的ｔａｃ启动子的启动下,表达活性比ｌａｃ启动子以及ｐＢＲ３２２载体上的Ｐ１和Ｐ２启动子高．     

二色桌片参酶解液的抗胃癌细胞MGc80—3作用

用二色桌片参［Ｍｅｎｓａｍａｒｉａｉｎｔｅｒｃｅｄｅｎｓ（Ｌａｍｐａｒｔ）］酶解液处理培养的人胃腺癌细胞ＭＧｃ８０－３后有如下效应：对其生长的抑制率可达３２．７５％，经处理后细胞铺展更好，透光性较好，细胞表面较光滑，微绒毛少，核膜规则而光滑，核仁明显．在软琼脂中的集落形成率由０．０１６７％下降为０．００４５％．Ｃｏｎ－Ａ介导的细胞凝集率在１００μｇ／ｍＬ浓度中下降４０．２个百分点，在２００μｇ／ｍＬ中下降３５．４个百分点；对裸小鼠致瘤的瘤重下降３３．０７％．结果表明二色桌片参酶解液对该胃癌细胞的生长有一定的抑制作用，对其恶性表型有一定的逆转作用．     

MTT法检测Rh-bFGF提高Balb/c3T3细胞酶活性及促细胞增殖作用

以Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３细胞为靶细胞,采用体外细胞培养方法,观察重组人碱性成纤维细胞生长因子的促分裂和提高酶活性作用。结果发现：重组人碱性成纤维细胞生长因子提高Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３细胞酶活性的最佳作用浓度为６．２５ｎｇ／ｍＬ（μｇ／Ｌ）,而促分裂增殖的最佳作用浓度为１００ｎｇ／ｍＬ（μｇ／Ｌ）。两者分别与应的对照组比较Ｐ＜０．０１,具有统计学意义。从而证实了重组人碱性成纤维细胞生长因子具有促分裂和增强酶活性的作用。     

环状芽孢杆菌中具有强启动活性DNA片段的结构与功能分析

作者曾用启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽孢杆菌Ｃ－２菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ－２）中克隆到一个具有强启动功能的２．４ｋｂ片段ＢＣ６．对该片段作作的进一步缺夫分析表明,其３’端约０．７ｋｂ片段具有单独的基因启动子功能,序列分析表明ＢＣ６片段３′端有典型的原核生物的基因启动子结构,现有ＢＣ６的５’端的１．２ｋｂＸｈｉＩ片段的重组于ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲＩ位点,观察其对两侧具有不同     

真菌纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究

采用能够转化细菌和真菌的双功能质粒ｐＤＬ１，与部分酶切的糙皮侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ）基因组ＤＮＡ片段进行体外重组。再用重组质粒ＤＮＡ转化玉米黑粉菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ，ｍａｙｄｉｓ）的原生质体，在平皿上筛选抗新霉素的转化子，转化率达８００转化子／μｇＤＮＡ，由此在玉米黑粉菌中建立了糙皮侧耳的基因文库。随机选出１５个转化子提取其ＤＮＡ，以３２Ｐ标记的ｎｅｕｒ基因酶切片段作为探针进行打点杂交，全部显示阳性，证明抗性菌落不是来源于敏感细胞的回复突变。以李氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）的纤维二糖水解酶（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒａｓｅｓ，简称ＣＢＨ）ＣＢＨⅡ基因末端片段为探针，从阳性克隆菌株中提取ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移并杂交，结果证明本研究已成功地克隆了糙皮侧耳纤维二糖水解酶ＣＢＨⅡ基因。基因的表达检测证明，克隆菌株具有纤维二糖水解酶活力。     

麦角隐亭产生菌的营养条件

麦角菌「Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ（Ｆｒ．）Ｔｕｌ．ＡＴＣＣ２００１９」发酵生产麦角隐亭的最佳碳源是蔗糖或工业葡萄糖，蔗糖的最适浓度为３０％，麦角 产量为９７．８－１０９．３μｇ／ｍＬ；发酵前期在１０％蔗糖培养基中再补加２０％蔗糖，可使产碱量比直接用３０％蔗糖的产碱量增加到１１１．９μｇ／ｍＬ，最佳氮源是酵母粉，蛋白胨，蚕蛹粉和黄豆饼粉。     

乙型肝为病毒（HBV）DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游,重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达,用纯化后的重组质粒直接注射用ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼细内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体,ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合。     

乙型肝炎病毒(HBV)DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游．重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达．用纯化后的重组质粒直接注射到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼肌内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体．ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合     

赤霉素的2.5次微分极谱分析

研究在０．６５ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４－０．１６ｍｇ／ｍＬ十二烷基苯磺酸钠条件下,赤霉素的氧化产物于－１．０Ｖ（ｖｓＳＣＥ）处产生的灵敏的２．５次微分极谱波的极谱行为,建立一个测定０．０８μｇ／ｍＬ～６μｇ／ｍＬ赤霉素的极谱分析方法。