病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定

通过特异引物PCR方法和水解圈活性法对62株苏云金芽胞杆菌菌株、26株蜡状芽胞杆菌菌株及18株球形芽胞杆菌菌株进行了几丁质酶产生菌的筛选.所测苏云金芽胞杆菌中除4株野生型菌株外均为阳性结果,蜡状芽胞杆菌仅1株为阴性结果,球形芽胞杆菌全为阴性结果,且水解圈法观察结果与PCR检测结果一致.在此基础上,通过DNS比色法对几丁质酶产生菌株的几丁质酶比活力也进行了测定.对这些具有致病性的病原芽胞杆菌几丁质酶的研究对于研究其致病机理及对其进行遗传改良具有重要的理论和实际应用价值.     

苏云金杆菌菌株产几丁质酶的合成条件研究

对本实验室筛选的苏云金芽孢杆菌QB－51的产酶条件研究表明：在pH7.0的基本培养基中添加2.0%的细粉几丁质，1.0%的蛋白胨，220r/min30℃下培养72h，几丁质酶的产量最高。     

重组巨大芽孢杆菌在小麦根际的定殖及其对植物真菌病害的防治效果

对含有外源几丁质酶编码基因的重组菌株——巨大芽孢杆菌B13011和B13012进行了小麦根际定殖能力，平板抑真菌能力和盆栽防病试验。两重组菌株均能在小麦根际及根内成功定殖；在盆栽条件下，对小麦全蚀病、小麦纹枯病、棉花立枯病、棉花枯萎病四种真菌病害的防效与受体菌B1301相比达显著性差异(P=0．05，LSR测验)，其中B13011对纹枯病的防治效果达到了81．61％。两重组菌株均能提高受试作物的生物量，其中B13011提高棉花的生物量达39．40％。     

苏云金芽孢杆菌BtR05普鲁兰酶基因pul在重组大肠杆菌中的自诱导表达

以苏云金芽孢杆菌BtR05基因组DNA为模板,PCR扩增得到其普鲁兰酶基因pul,构建了表达载体p ET(K)-Trx-pul,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG和自诱导表达系统分别对该酶基因进行诱导表达。Tricine-SDSPAGE结果表明,普鲁兰酶基因pul可通过自诱导获得大量表达。     

苏云金芽孢杆菌cry1I基因沉默的研究

分析了苏云金芽孢杆菌(Bt)cry1和cry1I基因的保守区,在cry1类基因的下游和cry1I基因的上游设计了一对通用引物,用于检测cry1I与cry1类基因的连锁现象.从鉴定的142株Bt分离株中,PCR扩增发现71株出现约1.4kb的阳性带,说明这一现象广泛存在于Bt菌株中.在此基础上用pGEM-T Easy载体克隆了菌株Bt07和J8中的连锁序列,序列分析表明,Bt07中是cry1I基因与cry1Db基因连锁,间隔区为504bp;J8中是cry1Ia基因与cry1Ac基因连锁,间隔区为506bp.进一步比较间隔区序列,同源性达93.7%,同时含有多个原核生物终止序列,且未发现启动子序列,揭示了这两个菌株中cry1I基因沉默的成因.     

新疆棉铃虫病原微生物分离及其高效杀虫微生物的筛选

从新疆不同生态区自然死亡的980头棉铃虫上分离到360株细菌和12株病毒,经鉴定,其中气杆菌344株,球孢芽孢杆菌8株,粘质赛氏杆菌6株,苏云金芽孢杆菌2株,HaNPV病毒12株,依次占分离物的92.5%、2.2%、1.6%、0.5%和3.2%。从中选出19株细菌、1株HaNPV进行生物测定,结果在供试菌株中以35号和360号菌株及HaNPV毒力最强,其感染棉铃虫后的死亡率分别为80.0%、70.0%、70.0%,对其进行不同浓度的试验,经回归分析,2株苏云金芽孢杆菌35号、360号和1株HaNPV对棉铃虫3龄幼虫的毒力与浓度有高度相关性(r>0.900)。     

源于地衣的苏云金芽孢杆菌分离及PCR-RFLP分析

以非维管植物地衣为分离材料,采用热处理加抗生素及醋酸钠的方法,经常规形态学鉴定,分离到6株苏云金芽孢杆菌.为了解其生物学特性,分别对这6株菌株进行生理生化测定和cry基因的PCR-RFLP检测,结果显示: 6个菌株均含有cry1、cry1I 、cry2基因,所有菌株均不含cry3、cry4、cry5、cry6、cry8、cry10、cry11基因.初步确定6株菌株中含有5种 cry1亚类基因(cry1Ad,cry1Ba,cry1Cb,cry1Da,cry1Ea),1种cry2亚类基因cry2Ac,2种cry1I基因亚类(cry1Ia1、cry1Ib1),其中有2个菌株的PCR-RFLP图谱均出现特异性片段,推测可能存在新基因.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

枯草芽孢杆菌2-3-2的抗线虫作用和产酶条件与酶特性

为了研究枯草芽孢杆菌2-3-2抗线虫作用与几丁质酶活的关系,对几丁质酶的产酶条件进行优化并探讨酶的特性,通过盆栽试验测定了抗线虫效果,用DNS定糖法测定了几丁质酶活力.实验结果表明:枯草芽孢杆菌2-3-2对南方根结线虫防治效果显著,其抗线虫作用与几丁质酶活性呈正相关.几丁质酶产酶培养基组成为(g/L):胶体几丁质65,酵母膏1,葡萄糖5,KH2PO40.7,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO40.01,NaCl 0.5,微量盐1mL/L;起始pH 7.0,温度为30℃、培养时间为72h.与优化前相比,酶活性提高了1.59倍,达到35.17×10-10 mol/s.枯草芽孢杆菌2-3-2几丁质酶最适反应温度为40℃,最适pH为7.0;温度高于50℃及碱性条件下酶活力下降.     

10种蔬菜内生细菌的分离筛选

以抑制植物主要病害病原菌和内生防病相关酶活性为评价标准,从蔬菜作物体内分离筛选植物内生细菌资源。从苦瓜、丝瓜、空心菜、大豆等10种蔬菜体内分离到101株细菌,发现内生细菌在不同种类的蔬菜中出现的频率不同,其中丝瓜叶上的内生细菌数量最多,洋葱体内分离到的内生细菌数量最少。运用平板对峙法从中筛选出了对黄瓜枯萎病菌、番茄青枯病菌、水稻细条病菌、荔枝霜疫霉病菌等有较强拮抗作用的菌株,获得对以上4种病菌均有拮抗作用的内生细菌有41株,占总株数的40．6％。对101株细菌进行纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性测定表明,同时具有3种酶活性的菌株有32株,占总菌数的31．7％。从中选出13株拮抗效果较好的内生细菌。经初步鉴定均属于芽孢杆菌属（Bacillus sp）。进一步对筛选获得的同时对以上4种病原菌均有拮抗作用,且具有纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性的13号、14号、59号和82号菌株进行16SrDNA序列分析,表明4个菌株均为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）或其近缘种。     

利用增强子样DNA片段提高几丁酶基因的表达

将来源于环状芽孢杆菌（Bacillus cirulans)C-2中增强子样DNA片段插入质粒pCHT1的几丁酶基因5’－端，构建成重组质粒pCHTX^ 和pCHTX^-。将含pCHT1,pCHTX^ 和pCHTX^-质粒的大肠杆菌转化子分别点种在几丁质平板上，不同菌株产生了不同大小的水解圈。利用比色法测定不同菌种的几丁酶活性发现，在大肠杆菌中，该片段的插入可促进几丁酶基因的表达，而在枯草杆菌中则没有明显的增强作用。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因在荧光假单胞菌中的表达

将已克隆到的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans)C-2的几丁酶基因chi1片段克隆到质粒载体pUXBF5中，得到重组质粒pUXCH1，该重组质粒在大肠杆菌中可以表达产生具有生物活性的几丁酶并分泌到胞外。将pUXCH1分别利用感受态法和三亲本杂交法转化荧光假单胞菌（Psendomonas fluorescens），在含有卡拉霉素的金氏B平板上筛得转化子。但将转化子点种于几丁质平板上却不能产生水解圈，提取细胞内容物后用比色法也没有检测到有效的酶活性。该研究表明环状芽孢杆菌 的几个酶基因chi1已经被成功的整合到荧光假单胞菌的染色体上，但却没有表达或表达效率极低，这可能是由于荧光假单胞菌的表达系统不能正确有效的识别存在于该chi1几丁酶基因片段中的环状芽孢杆菌基因启动子而造成的。     

提高苏云金芽孢杆菌制剂杀虫效果的策略

苏云金芽孢杆菌制剂是一种主要的生物杀虫剂 ,本文从培育高效菌株、增加昆虫对 Bt的摄入量、化学杀虫剂促进 Bt的杀虫作用、植物次生物质的增效作用、Bt与其杀虫微生物及其代谢产物的协同作用、简单化合物提高 Bt的毒力以及保护 Bt免受紫外光的损伤等方面提高 Bt制剂的杀虫活性进行了论述。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的PCR-RFLP鉴定分析

利用PCR—RFLP技术对含有已知cry1基因的8株标准菌株和2株遗传工程菌进行了基因分析，证实了该方法的可行性．并在此基础上鉴定了分离保藏的70株B．t菌株的cry1型基因，结合SDS—PAGE分析以及室内生物测定结果，讨论了基因型与蛋白表达及毒力之间的关系．     

染料脱色细菌的筛选及脱色条件的研究

从保定某印染厂印染废水中分离到13株具有较好脱色能力的细菌,其中1株对直接黑绿、1株对活性红、1株对直接大红GBE、3株对直接胡蓝、7株对活性艳红X-3B有脱色能力.在最适条件下其脱色率都达到80%以上,尤其对直接胡蓝有脱色能力的3株菌脱色率达到100%.研究了这13株细菌在不同温度、pH值、供氧量条件下对所试染料的脱色情况.并根据各菌株的个体形态、群体形态和生理生化特征对这13株脱色细菌进行了初步鉴定.     

一株生防烟管菌几丁质酶表达及抗真菌活性

为了探究烟管菌BK-1的生物防治潜力,本研究测试了一株具有生防菌活性的烟管菌BK-1的抗病效果,并使用RT-qPCR分析了该菌株的8个细胞壁裂解酶基因在与不同病原真菌对峙培养中的表达水平,结果表明,在应对链格孢、茄链格孢、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢这4种病原真菌时,几丁质酶基因BaCHIB表达上调了27.3至50.3倍,远高于其他7个基因.BaCHIB属于糖苷水解酶18家族(GH 18),并具有Chic_BD结构域,属于B类几丁质酶(CHIB).结合基因表达谱分析,该基因诱导表达上调情况的出现与抗病效果的出现高度同步.外源表达蛋白BaCHIB显示出较高的几丁质酶活性,且表现出对多种植物病原真菌,包括链格孢,链格孢和灰葡萄孢显著的抗真菌活性,显示其对部分病原真菌具有拮抗能力.     

抗稻瘟病和纹枯病的转基因水稻新品系

将水稻碱性几丁质酶基因（RC24）导入优良灿稻品种竹籼B,外源RC24基因可以稳定整合到RO代至R6代转基因水稻基因组中,并得到表达,已获得同时抗稻瘟病和纹枯病的转基因品系竹转68和竹转70以及43个转基因纯合株系。