CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的抑制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子对人类白细胞抗原Ⅱ类分子表达的影响，用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到ＣⅡＴＡ基因ｃＤＮＡ５’端片段，构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体ｐｃＤＮＡ－Ⅱ，基因转移ＨＬＡⅡ类分子诱导型表达的ＨｅＬａ细胞，ＩＦＮ－γ诱导，发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降，而ＨＬＡ Ｉ类分子的表达不受影响。实验     

人神经元电压门控钙通道γ-3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析，得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在 ４３５ ｂｐ中有 ７５％同源的 ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｗ２９０９５）．在该 ＥＳＴ中设计引物与 ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ反应，在人脑前叶皮质 ｃＤＮＡ文库和人脑 Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得 ｃＤＮＡ序列 １５４５ ｂｐ，其中包含一个 ９４８ ｂｐ的可读框，编码 ３１５个氨基酸．该可读框经确证命名为 ＣＡＣＮＧ３．ＣＡＣＮＧ３基因与大规模测序中定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１的ＢＡＣ克隆ＡＣ００４１２５完全一致，从而将该基因定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１，并由此获得它的基因组结构，编码区由４个外显子组成．经ＲＴ－ＰＣＲ分析，ＣＡＣＮＧ３在成人脑和胎脑有表达．运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ在视网膜色素变性家系、视网膜色素变性伴耳聋和癫痫家系进行突变检测，未检测到突变．     

小麦黄花叶病毒72ku蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备

采用逆转录－ＰＣＲ方法，扩增获得小麦黄花叶病毒（ＷＹＭＶ）ＲＮＡ２上的７２ｋｕ蛋白基因，将其克隆到ｐＥＴ３０ａ（＋）上，构建了该基因的原核表达载体ｐＥＴＰ７２。ＳＤＳ－ＲＡＧＥ分析结果显示，经ＩＰＴＧ诱导，７２ｋｕ蛋白基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中得到高效表达。以含表达产物的凝胶作为抗原，免疫家兔，首次制备了小麦黄花叶病毒ＲＮＡ２７２ｋｕ蛋白特异性抗血清。     

含RGD环六肽与整合素蛋白α_(Ⅱb)β_3的结合反应

ＲＧＤ序列普遍存在于细胞外基质蛋白中，并能为许多整合素蛋白所识别．利用 ＥＬＩＳＡ，ＳＰＲ等技术，对表面固定的人工合成生物素－含 ＲＧＤ环六肽［ｃｙｃｌｏ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－）］与人血小板整合素蛋白α_（Ⅱｂ）β_３的结合能力进行了检测结果表明，含ＲＧＤ环六肽与生物素基团之间的间臂长度在 １．４８～２．２ ｎｍ时， ＲＧＤ序列才能有效进入α_（Ⅱｂ）β_３以头部的反应中心并发生结合反应；反应的平衡解离常数为 １．１μｍｏｌ／Ｌ．为在固体表面研究整合素蛋白介导的细胞吸附过程提供了一个理想的模型系统．     

人HCUTA全长cDNA的克隆与原核表达

人ＨＣＵＴＡ是最近克隆的一个新的全长cＤＮＡ，编码蛋白可能参与人铜离子容受系统。 ＪＣＩＴＡ的全区用〗ＣＲ拉示后。克隆到ｐＥＴ２８ａ＋表达载体中，在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得了高效表达，表达的ＨＣＵＴＡ重组蛋白细菌总蛋白的２８．３％。ＨＣＵＴＡｃＤＮＡ的ＧｅｎＢａｎｋ接收号为ＡＦ１０６９４３。     

VK3诱导的植物细胞凋亡及其机理

ＶＫ３可诱导烟草细胞的凋亡，表现为：染化体凝集，凋亡小体形成，ＤＮＡ末端断裂、降解形成梯状电泳，此过程伴随特异核酸酶的激活，其活性依赖于Ｃａ＾２＋，Ｍｇ＾２＋，可被Ｚｎ＾２＋和ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ）抑制。ＤＮＡ降解可被ＤＥＶＤ（Ａｃ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－ａｌｄｅｈｙｄｅ）抑制。核纤层蛋白降解为３５ｋｕ片段，ＤＥＶＤ，ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔ     

Pfu酶基因的克隆、表达、纯化及长距离PCR的研究

用ＰＣＲ方法从Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ的总ＮＤＡ扩增出了含有Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌＡ基因的２．３ｋｂ片段,并将该基因克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。用ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ对重组质粒ｐＴ－ｐｆｕ进行了酶切。并将ｐｆｕ ｐｏｌＡ基因捶 入表达载体ｐＥＴ－３ｄ－Ｘ。     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母ＤＭＣ１基因是一个在减数分裂前期 Ｉ表达的减数分裂特异基因，其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的．根据在酵母Ｄｍｃ１与拟南芥ＡｔＤｍｃ１中保守的氨基酸ｍｏｔｉｆｓ合成的简并性引物，以ｃＤＮＡ作模板，通过套式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）和ＲＡＣＥｓ克隆了水稻中酵母ＤＭＣ１的同源基因 ＯｓＤＭＣ１．ＯｓＤＭＣ１全长的 ｃＤＮＡ是 １３４８ ｂｐ，编码 ３４４个氨基酸组成的多肽（ＯｓＤｍｃ１）． ＯｓＤｍｃ１与 Ｄｍｃ１和ＡｔＤｍｃ１的氨基酸序列一致性分别是５１．８％和８１．７％．ＯｓＤＭＣ１在生殖器官中表达量较高，在根中有少量表达，而在叶和幼芽中不表达． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的 ＯｓＤＭＣ１．     

含RGD环六肽与整合素蛋白αⅢbβ3的结合反应

ＲＧＤ序列普遍存在于细胞外基质蛋白中，并能为许多整合素蛋白所识别。利用ＥＬＩＳＡ，ＳＰＲ等技术，对表面固定的人工合成生物素－含ＲＧＤ环六肽〔ｃｙｃｌｏ－（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－）〕与人血小板整合素蛋白αⅡｂβ３的结合能力进行了检测。结果表明，含ＲＧＤ环六肽与生物素基团之间的间臂长度在１．４８￣２．２ｎｍ时，ＲＧＤ序列才能有效进入αⅡｂβ３头部的反应中心并发生结合反应；     

人和鼠GRY-RBP cDNA的克隆

通过筛选人胎儿脑ｃＤＮＡ文库，克隆了编码一个新的ＲＮＡ结合蛋白的人ｃＤＮＡ，命名为ＧＲＹ－ＲＢＰ，人ＧＲＹ－ＲＢＰ ｃＤＮＡ的长度为２９３２ｂｐ，编码一个具６２３个氨基酸，分子量为６９．６ｋｕ的ＲＮＡ结合蛋白。ＧＲＹ－ＲＢＰ蛋白含有３个ＲＮＡ识别基序（ＲＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ，ＲＲＭｓ）和一个富含甘氨酸（Ｇ）、精氨酸（Ｒ）、酷氨酸（Ｙ）的羧基端，经数据库比较发现该蛋白与许多ＲＲ     

双价、三价种子特异性表达载体的构建及表达PHB合成相关基因的转基因油菜的获得

分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用已经克隆的合成聚羟基丁酸酯的３个关键酶基因，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合ｐｈｂＣ（编码ＰＨＢ合酶）、ｐｈｂＢ（编码依赖ＮＡＤＰＨ的乙酰－ＣｏＡ还原酶）的二价及嵌合ＰｈｂＣ、ｐｈｂＡ（编码３－酮硫裂解酶）、ｐｈｂＢ的三价表达载体，并由导肽将基因表达产物定位于质体．经根瘤农杆菌介导获得转基因油菜，并进行了ＰＣＲ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ及ＲＴ－ＰＣＲ－ＤＮＡ杂交等分子检测．     

转基因小鼠中糜酶在心脏血管紧张素Ⅱ形成中的作用

为研究人心糜酶（ｈＣｈｙｍａｓｅ）在心脏血管紧张素Ⅱ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ，ＡｎｇⅡ）形成中的作用及在心肌重塑过程中的意义，建立了ＭＬＣ２－人心糜酶转基因小鼠，用ＲＴ－ＰＣＲ方法分析了糜酶基因的组织特异性表达和心脏中Ⅰ，Ⅲ型胶原基因的转录表达，并用放射免疫法检测了心脏糜酶及血管紧张素转换酶（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ＡＣＥ）活力以及心脏和血浆的ＡｎｇⅡ含量，用     

人类肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位

蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式．甲硫氨酸（Ｍｅｔ）被氧化则变为甲硫氨酸亚砜（Ｍｅｔ（Ｏ）），它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失，但肽－甲硫氨酸亚砚还原酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ， ｍｓｒＡ）则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，使其所在蛋白质重新恢复活性．为了研究人体中Ｍｅｔ氧化还原的机制，以牛ｍｓｒＡ ｃＤＮＡ序列为信息探针，筛选人ＥＳＴ数据库，依据若干同源ＥＳＴ的信息从人ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个长１２５５ｈｐ的人ＭＳＲＡ ｃＤＮＡ．该ＣＤＮＡ包含一个长７０５ ｂｐ的可读框，它编码了 ２３５个氨基酸残基．同源性比较表明，该基因与牛和大肠杆菌的ｍｓｒＡ基因的氨基酸一致性分别为８８％和６１％．表达谱分析发现，该基因在人体大多数组织中均有一条长约１．６ｋｂ的转录本，并在肾中呈高表达．应用辐射杂种细胞株定位系统（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ， ＲＨ ｍａｐｐｉｎｇ）将该基因精确定位在人染色体８ｐ２２～２３区带的ＤＳＳ５１８和Ｄ８５５５０位标之间，由于此前已有Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃｗｉｎｔｅｒｅｒｙｔｈ     

花药特异性表达的类查尔酮合酶基因D5与水稻花粉发育相关

采用ＲＮＡ原位杂交技术对水稻类查尔酮合酶基因Ｄ２进行细胞定位，结果表明Ｄ５基因特异地在水稻花药的绒毡层及维管束周围细胞中大量表达。为了进一步研究其功能，将水稻 劝蛋白基因（Ａｃｔｉｏｎｌ）启动子驱动的Ｄ５正义及反义基因分别转入水稻中，对转基因水稻花粉不同发育时进行观察，发现表达反义Ｄ５义及反义基因分别转入水稻中，对转基因水稻花粉不同发育时期进行观察，发现表达了反义Ｄ５基因的花粉其形态表现明显不正常     

PKCα反义RNA对乳腺癌细胞增殖及cyclinD1和CDK4表达的影响

ＰＫＣ,ｃｙｃｌｉｎ和ＣＤＫ基因直接参于调控细胞的增殖与分化,因此它们在细胞癌变中的作用已成为重要的研究课题。利用反义ＲＮＡ技术抑制ＰＫＣａ基因的表达,然后观察分析了乳腺癌细胞增殖的变化以及对ｃｙｃｌｉｎＤ１和ＣＤＫ４基因表达的影响。     

人β-簇珠蛋白基因上游远侧端调控元件与GATA转录因子结合模式

用羟基脲诱导ＨＥＬ细胞，将诱导前后细胞核内蛋白质因子与人β－类珠蛋白基因ＬＣＲ调控元件内ＤＮａｓｅⅠ超敏感点Ⅲ和Ⅳ核心ＤＮＡ序列（ＨＳ３－１４７１６－－１４９９１ＢＰ和ＨＳ４－１８３０６－１８５８６ＢＰ）的结合模式进行了分析，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明，随着羟基脲诱导ＨＥＬ细胞时间的延长，细胞核内ＧＡＴＡ－２的含暧渐减少；与之相反，ＧＡＴＡ－１的含量却随着诱导的时间而增加。结合竞争性ＥＭＳ     

CDK4反义RNA对乳腺癌细胞增殖及cyclinD1,cyclinE和CDK2表达的影响

利用反义ＲＮＡ抑制乳腺癌细胞中ＣＤＫ４基因的表达,观察分析了此基因与癌细胞增殖速率,成瘤性以及与ｃｙｃｌｉｎＤ１,ｃｙｃｌｉｎＥ和ＣＤＫ２表达的相关性,当ＣＤＫ４表达受到抑制后,细胞的增殖速率和致瘤性明显降低,显示出ＣＤＫ４在乳腺肿瘤发生与发展中的重要作用,ｃｙｃｌｉｎＥ基因的表达水平有较大程度的下降,ｃｙｃｌｉｎＤ１和ＣＤＫ２基因表达水平变化较小,可以推测ｃｙｃｌｉｎＥ的表达依赖于ＣＤＫ４的诱导     

利用基因工程方法研究生物标志化合物分子来

利用 ＤＮＡ体外重组技术构建了蓝细菌Ｓｙｎｅｃｈｏｃｈｓｔｉｓ ｓｐ ＰＣＣ ６８０３缺失突变株ＯＲＦ４_（４６９０），其染色体ＤＮＡ中与不依赖于光的叶绿素合成途径相关的ＯＲＦ_（４６９）片段被红霉素抗性基因所取代．该突变株细胞内叶绿素的含量完全受培养过程中光的控制．培养获得的叶绿素含量分别为９．４２７μｇ· ｍｇ~（－１）和 ０．６９５ μｇ· ｍｇ~（－１）的两类藻细胞在实验室条件下进行了热模拟降解，分析了热解产物烷烃生物标志物特征，发现两类细胞在类异戊二烯烃的相对含量上差异明显．低叶绿素含量的蓝藻样品热解产物中Ｐｒ／ｎＣ_（１７）和Ｐｈ／ｎＣ１８值为０．１９２和０．２１６，分别是高叶绿素含量蓝藻样品的１／３和１／７。实验结果为叶绿素分子是植烷和姥鲛烷等类异戊二烯烷烃的分子来源提供了直接的证据，并进一步证实了藻细胞中脂类分子是决定其热解产烃量的主要控制因素．实验结果表明，现代分子生物学与有机地球化学的结合可以为某些生物标志化合物的分子来源研究提供新的可行途径。     

小鼠胸腺上皮细胞株MTEC1表达的化学趋化因子的类型分析

以自行设计的引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法从小鼠胸腺上皮细胞株ＭＴＥＣ１的总ＲＮＡ中扩增出了ＳＤＦ－１α，ＩＰ－同和Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ等６种化学趋化因子的ｃＤＮＡ片段，对扩增片段进行了酸测序鉴定，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析结果显示；ＳＤＦ－１ｍＲＮＡ在ＭＴＥＣ１细胞株中存在两种不同的剪切形式，ＭＴＥＣ１的浓缩培养上清对小鼠胸腺ＣＤ＾４－ＣＤ＾８Ｔ细胞具有中等强度的趋化活性，符合ＳＤＦ－１的生物学功能。     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨 ＣＤ２分子的信号传递功能，以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈｒ２１１－Ｇ１ｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”，采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ｃＤＮＡ序列．并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内与ＣＤ２胞内区结合的特异性．克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胞内蛋白分子，与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－１）同源 Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体转运蛋白质．蛋白数据库检索表明，Ｆｔｅ－１具有蛋白激酶ＰＫＣ的结合与作用位点，提示Ｆｔｅ－１参与ＣＤ２分子介导的信号传递