黑线仓鼠GAL克隆及生物信息学分析

以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为对象,采用RT-PCR技术克隆黑线仓鼠GAL cDNA序列482 bp,采用生物信息分析软件对GAL进行基因序列分析表明,结果显示GAL包括完整CDS区375 bp和部分5′和3′非编码区,共编码124个氨基酸,GAL蛋白质分子量为13199.05 Da,其不稳定指数为44.67,高于40,表明GAL蛋白不稳定.GAL含有信号肽,为分泌蛋白.同源性比对及系统进化树分析,数据显示黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)与中国仓鼠(Cricetulus griseus)亲缘关系相对较近,而与啮齿类等亲缘关系次之,与灵长类及其他鸟类物种亲缘关系较远,这与传统的物种分类较为一致,进而验证克隆所得到的GAL cDNA序列准确,体现了GAL进化的保守性,为探究GAL在动物繁殖调控中的作用提供了一定的理论基础.     

黑线仓鼠Cry1、Cry2克隆及生物信息学分析

隐花色素(Cryptochromes,包括Cry1和Cry2)编码黄素腺嘌呤二核苷酸结合蛋白,是昼夜节律核心振荡器复合物的关键组分,是各种生理功能的重要调节因子.本实验以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为材料,通过设计特异性引物,RT-PCR技术克隆得到黑线仓鼠Cry1 cDNA序列1822 bp(GeneBank登录号:MK796241)、Cry2 cDNA序列1945 bp(GeneBank登录号:MK796242).运用生物信息学对Cry1、Cry2核酸序列以及蛋白质序列进行分析,构建系统进化树,结果表明:测得的Cry1 cDNA包括一个完整的开放阅读框1764 bp,部分5′端非翻译区和部分3′非翻译区,编码587个氨基酸,A+T含量略高于G+C含量;测得的Cry2的cDNA包括一个完整的开放阅读框1794 bp,部分5′端非翻译区和部分3′非翻译区,编码597个氨基酸,G+C含量远高于A+T含量,提示其Tm值较高,热稳定性强. CRY1、CRY2理论蛋白分子量为66469.86 Da、67427.08 Da,等电点(pI)为8.40、8.82,均为不稳定蛋白. CRY1、CRY2蛋白跨膜区和疏水性分析和信号肽分析等均表明,整体疏水性不强,为亲水性蛋白;没有信号肽,不属于分泌蛋白,与其作为转录抑制因子相符合.功能结构域预测表明,二者均含有两个高度保守的功能结构域:DNA光解酶及FAD结合域.同源性比对及系统进化树分析显示,黑线仓鼠与中国仓鼠亲缘关系最近,与灵长类目及鸡形目亲缘关系较远,这与传统的分类物种分类方式相一致,证实本实验测得的Cry1、Cry2基因序列正确,体现了Cry1、Cry2进化的保守性.本实验为探究昼夜节律基因Cry1、Cry2在动物繁殖调控中的作用奠定了基础,具有重要的理论意义.     

黑线仓鼠OPN5的部分克隆及生物信息学分析

神经视蛋白(Neuropsin,OPN5)是非视觉成像蛋白的重要成员之一,主要分布于动物的眼睛、脊髓、大脑和睾丸中,是动物感光物质的重要组成成分.文章以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为动物材料,利用RT-PCR技术克隆得到黑线仓鼠OPN5基因的cDNA序列1340bp(KY949483).生物信息学分析表明,该序列包括一个完整的开放阅读框架1134bp,部分5'端非翻译区和部分3'端非翻译区;序列G+C含量远高于A+T含量,提示其Tm值较高,热稳定性强;编码377个氨基酸;蛋白质序列组成、跨膜区和疏水性分析、信号肽分析等均表明,OPN5序列包含N端胞外区、跨膜域和C端胞内域,整体疏水性较强,没有信号肽,不属于分泌蛋白,这些特征均与OPN5膜蛋白的属性相符;OPN5包括7个跨膜拓扑结构、一个G蛋白偶联受体家族和一个视黄醛结合位点,第7个跨膜结构的赖氨酸残基与OPN5对紫外光的敏感性有关;同源性对比显示,黑线仓鼠与中国仓鼠(Cricetulus griseus)、金仓鼠(Mesocricetusauratus)、小鼠(Mus musculus)亲缘关系较近,而与灵长类、偶蹄类的物种亲缘关系均较远,这与传统的物种分类相一致,证实所克隆到的序列正确,同时提示OPN5进化的保守性.本研究为探究OPN5视蛋白在动物繁殖调控中的作用奠定了基础,具有重要理论的意义.     

黑线仓鼠AVP基因部分序列的系统进化及结构分析

根据GenBank中黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）同源物种的AVPcDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术得到了黑线仓鼠精氨酸加压素（AVP）基因部分cDNA序列,包括外显子2的全部序列和外显子1、3的部分序列,共433bp,并注册到GenBank（登录号：JN227681）。该段序列共编码143个氨基酸,二级结构预测显示片段中含较多的a螺旋。该序列与其他物种相应区域的比较结果表明其同源性为84％～92％,氨基酸序列同源性为82％-93％。系统进化分析结果与物种亲缘关系的远近一致,该序列的克隆为研究AVP的表达调控机制奠定了基础,将有助于AVP的作用机制的研究及功能分析,同时该cDNA序列可作为物种亲缘关系或遗传距离研究的理想标记。     

黑线仓鼠 KiSS-1基因的生物信息学与系统进化研究

采用 RT-PCR 技术克隆得到黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)KiSS-1基因的部分序列,并进行生物信息学分析.结果表明:该段序列共429 bp,包含部分5′非翻译区、转录起始位点、信号肽序列以及主要的活性区域.黑线仓鼠 KiSS-1编码的蛋白质是一种胞外分泌的亲水性蛋白质,N 端含有19个氨基酸组成的信号肽序列,67、121-122位各有一个水解位点,68、69处的磷酸化位点可能与蛋白质活性的获得有关.二级结构预测含有较多的α螺旋和自由卷曲,115-119位的α螺旋在与受体结合中有重要作用.系统进化分析证实该序列与其他物种有较高的同源性,说明该基因在进化中相对保守.通过生物信息学与系统进化分析,有助于进一步揭示 KiSS-1的转运加工途径及作用机制     

黑线仓鼠KiSS-1基因的生物信息学与系统进化研究

采用RT-PCR技术克隆得到黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)KiSS-1基因的部分序列,并进行生物信息学分析。结果表明:该段序列共429bp,包含部分5’非翻译区、转录起始位点、信号肽序列以及主要的活性区域。黑线仓鼠KiSS-1编码的蛋白质是一种胞外分泌的亲水性蛋白质,N端含有19个氨基酸组成的信号肽序列,67、121-122位各有一个水解位点,68、69处的磷酸化位点可能与蛋白质活性的获得有关。二级结构预测含有较多的α螺旋和自由卷曲,115-119位的α螺旋在与受体结合中有重要作用。系统进化分析证实该序列与其他物种有较高的同源性,说明该基因在进化中相对保守。通过生物信息学与系统进化分析,有助于进一步揭示KiSS-1的转运加工途径及作用机制。     

黑线仓鼠催乳素受体（PRLR）基因部分序列的克隆与序列分析

采用基因克隆方法首次扩增出黑线仓鼠催乳素受体（Prolactin Receptor,PRLR）基因5’端部分序列（GenBank登录号为EU826030）,测序结果表明该片段的有效长度为379bp,包含部分5’调控区、exonl及部分intron1．该序列与其它物种相应区域的同源性比较结果：黑线仓鼠与人、大鼠、小鼠、狐猿、黑猩猩、类人猿PRLR基因核苷酸序列的同源性为82．1％-93．4％;exon1序列的同源性为79．8％-91．4％．系统进化分析与物种亲缘关系的远近一致,同时证明PRLR基因exon1有较大的可变性,因此认为成功克隆了黑线仓鼠的PRLR基因的部分序列．该研究所得到的PRLR基因序列可用作研究物种亲缘关系或遗传距离的理想标记．     

黑线仓鼠4.5S RNA cDNA的克隆及序列分析

4.5S RNA是一种特异存在于啮齿类细胞中丰富的核小RNA分子（small nuclear RNA,snRNA）.研究以黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）为材料,从新鲜肝脏中提取总RNA,以此反转录4.5S RNA cDNA序列,并克隆测序,所得核苷酸序列为88 bp(Genbank登录号:HM1...     

黑线姬鼠OPN部分编码区结构与分子系统进化分析

以近缘种OPN的cDNA序列为参考设计引物,通过RT-PCR得到黑线姬鼠OPN部分序列,并将得到的cDNA序列翻译成氨基酸序列,注册到GenBank(登陆号:HM626723).利用该序列构建系统进化树,同时对其编码的蛋白质进行一级结构分析及二级结构预测.结果表明:克隆得到的209 bp OPN的序列,包括部分外显子4...     

黑线仓鼠LHR部分序列的克隆与分析

以大鼠、小鼠、金仓鼠(Mesocricetus auratus)的同源保守序列设计了黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)黄体生成素受体基因(LHR)的引物,经PCR扩增得到了154 bp的目的产物,通过Blast证实该片段是黑线仓鼠的LHR序列.该段序列处于第11外显子的5'端,编码51个氨基酸,包含...     

黑线仓鼠MHCⅡ类DQA基因外显子2的克隆与序列分析

为了探明黑线仓鼠MHC的结构与功能并寻找分子标记,对MHCⅡ类DQA基因的外显子2进行克隆和序列分析．提取黑线仓鼠3个群体（吴村、沂南和临朐）的基因组DNA构建基因池,利用PCR技术扩增得到249bp的片段,将该目的片段连接到pMD18-T载体中,重组质粒转入大肠杆菌DH5α后利用蓝白斑法筛选阳性克隆,测序后得到该目的片段的核苷酸序列（Genbank登录号：FJ209306）并推导出氨基酸序列．结果表明：黑线仓鼠、人类、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间DQA基因外显子2的核苷酸序列同源性为68．7％-85％,氨基酸序列同源性为56．8％-83．5％,黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近．测序得到的OQA基因外显子2的序列在物种间具有丰富的多态性,可以作为物种遗传分析的分子标记．     

太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44基因克隆及分子特征分析

采用RACE技术首次克隆太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44全长cDNA序列,并命名为EpCYP4C和EpCYP44。EpCYP4C基因全长序列2 032 bp,5’非翻译区60 bp,3’非翻译区487 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;EpCYP44全长cDNA序列1 752 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸,5’非翻译区85 bp,3’非翻译区182 bp。经预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白具有CYP450家族蛋白特有的血红素结合区FxxGxxxCxG;而且EpCYP4C蛋白具有CYP4家族基因特征序列EVDTFMFEGHDTT。通过多序列比对和系统进化树分析发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白与近亲真宽水蚤同源性更高,亲缘关系更近。蛋白二级结构预测显示EpCYP4C和EpCYP44蛋白主要以α螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白分布在细胞质和线粒体的可能性较大,这可能与CYP450酶系的解毒代谢机制相关。研究结果说明太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因均为CYP450酶系,且太平洋真宽水蚤EpCYP4C基因属于CYP4家族。对太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因的序列分析为进一步研究EpCYP4C和EpCYP44基因在污染物暴露下的表达奠定理论基础;同时有助于了解海洋桡足类CYP450超家族的分子特征。     

大熊猫核糖体蛋白L34基因cDNA克隆与蛋白特性

为进一步研究RPL34的结构基因,也为更深入开展大熊猫分子生物学研究积累科学资料,本研究采用RT-PCR方法,首次成功克隆了大熊猫的核糖体蛋白L34基因的cDNA序列,对克隆序列进行了测序及初步分析,并利用RPL34蛋白构建系统树.结果表明:大熊猫RPL34基因的表达序列全长为379 bp,ORF为354 bp,编码117个氨基酸的蛋白质,该蛋白分子量为13.292 9 kD,等电点(pI)为11.48,含有5种类型共11个功能位点.进一步分析发现,该基因与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等物种的编码序列及其编码的氨基酸序列同源性很高,蛋白质分子量、pI非常接近,功能位点基本相同,说明核糖体蛋白L34基因及其编码蛋白在进化过程中非常保守;进化树分类结果与传统分类一致,表明L34蛋白能很好的反映物种间的进化关系.     

草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从草鱼肌肉组织中克隆出MSTN cDNA序列,长度为1764 bp,编码区为1128 bp,共编码375个氨基酸.前体蛋白包括信号肽序列、N端前肽区、蛋白酶水解位点RIRR及C端活性区(含9个保守的Cys残基).多重序列比较表明,草鱼与斑马鱼、黑头软口鲦之间的MSTN序列同源性在94%以上,与其它鱼类之间的序列同源性也较高(78.1%~82.3%),但与鸟类、哺乳类之间的序列同源性则相对较低.系统进化分析显示,不同物种间的MSTN序列同源性基本反映了它们的亲缘关系.     

麻疯树P5CS基因的克隆及原核表达

使用RACE技术,从麻疯树叶片中克隆了Δ1吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,命名为JcP5CS. JcP5CS的cDNA全长2675 bp,包含一个2148 bp的开放阅读框,一个117 bp的5’-非翻译区以及一个410 bp的3’-非翻译区.开放阅读框编码716个氨基酸多肽链,分子量为77.54 kD,预测等电点为6.11.通过与其它物种的P5CS氨基酸序列比对,结果显示,与其他高等植物的P5CS氨基酸序列有很高的同源性.包含谷氨酸激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氢酶两个结构域以及ATP及NAD (P     

赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析

采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC IA基因的4个cDNA全序列,序列全长为1 680bp,含有3′UTR、启动子、多肽结合区(α1)、IGC区(α2)、跨膜区、胞质区和5′UTR区,编码区大小为1 074～1 080bp,共编码357～359个氨基酸,推测蛋白质分子质量约41.66ku.氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHC IA分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区则存在极其丰富的变异.利用Real time PCR和SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC IA的组织表达特异性和表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,表达多态性也异常丰富,而在与外界环境接触较多的鳃、肌肉、肠等组织表达较弱.此外,根据MHC IIB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记.     

拟松材线虫两个HSP基因的克隆与分析

采用RACE(快速扩增cDNA末端)技术从拟松材线虫中克隆了HSP70蛋白编码基因mc2和HSP90蛋白编码基因mc19,两个基因的全长cDNA分别为2 067和1 222 bp。生物信息学分析结果表明：mc2基因的ORF为1 926 bp,推测的编码蛋白包含642个氨基酸,分子质量为170.85 ku,等电点为4.69。mc19基因的ORF为1 083 bp,推测的编码蛋白包含361个氨基酸,分子质量为97.70 ku,等电点为4.83。多序列比对和系统进化树结果分析都表明,拟松材线虫的mc2、mc19基因的编码蛋白与植物寄生线虫HSP70和HSP90蛋白具有较高的同源性,拟松材线虫和松材线虫之间的亲缘关系尤其密切。     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.     

结球甘蓝γ-生育酚甲基转移酶cDNA的克隆、分析及其异源表达酶蛋白的功能研究

采用3′-和5′-RACE技术,从结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)幼苗顶芽中克隆了γ-生育酚甲基转移酶的全长cDNA序列(BoTMT).该cDNA长1265bp,包含一个1044bp的开放阅读框,编码包括叶绿体导肽和两个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)在内的347个氨基酸组成的蛋白质.序列分析表明该蛋白质与目前已知的γ-生育酚甲基转移酶有41.8%～86.5%的同源性.半定量RT-PCR结果显示BoTMT主要在结球甘蓝的花和叶器官中表达.将BoTMT的成熟蛋白编码区序列克隆至原核表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的22%.体外酶活性测定结果表明表达的蛋白质具有γ-生育酚甲基转移酶活性,能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚.     

豌豆cop1 cDNA的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以拟南芥cop1 cDNA为探针,从豌豆(Pisum sativum) cDNA文库中克隆到了豌豆cop1 cDNA。序列分析表明,它全长为2863bp,其中包括604bp 5′非编码区、243bp 3′非编码区和2016bp编码区,编码672个氨基酸。在大肠杆菌中实现了豌豆cop1基因的高效表达。对拟南芥、豌豆和番茄3种植物cop1的序列同源性比较表明,cop1可能是一种进化上很保守的蛋白质。