尾静脉大容量快速注射法介导的人凝血因子Ⅸ基因在小鼠肝内的高效表达

尾静脉大容量快速注射裸质粒DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达, 采用此方法将人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达质粒pCMV-hFⅨ 2.2 mL于7 s内导入小鼠体内, hFⅨ在小鼠体内表达水平最高为2921 ng/mL(血浆). hFⅨ表达水平与裸质粒DNA注射剂量呈正相关, 重复注射的hFⅨ表达水平偏低(最高1459 ng/mL). PCR检测发现小鼠多种器官中存在hFⅨ cDNA, RT-PCR和免疫组化切片检测表明, hFⅨ mRNA和蛋白主要在肝脏中表达. 转氨酶水平与病理切片检测表明, 注射1 d后5%的肝脏细胞受到损伤, 但在3 ~ 10 d内恢复. 研究结果表明, 尾静脉大容量快速注射法能够介导hFⅨ在小鼠体内高水平表达, 为基因治疗研究提供了一项简便而实用的动物实验手段.     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

利用精原干细胞建立人凝血因子Ⅸ转基因小鼠

用玻璃针将Effectene^TM包裹的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达载体注入小鼠的曲精细管. 通过PCR和Southern印迹法对子代41只小鼠进行鉴定, 有2只小鼠的基因组中整合有hFⅨ基因表达框架, 整合率为4%(2/41). 通过ELISA方法在其中1只小鼠的血浆中检测到hFⅨ的表达, 表达量为4.6 ng/mL. 实验证明, 精原干细胞法是建立转基因动物的有效途径, 为乳腺反应器的研究提供了另一个技术手段. 同时也为通过生殖细胞途径治疗血友病B提供了新的选择.     

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 10¹² vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 10¹¹ vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.     

VSV-G假型反转录病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在新生血友病B小鼠中的有效转移和表达

研究探索了VSV-G假型反转录病毒invivo途径基因治疗血友病B的可行性.采用新型包装细胞系293-GPG制备了VSV-G/G1NaBAⅨ假型病毒,该病毒的最高滴度可达8.5×108CFU·mL-1,与传统的反转录病毒相比具有更高抗补体灭活效应(P<0.001),并初步证实了新生鼠血清补体对VSV-G假病毒的灭活作用明显弱于成年鼠血清补体(P<0.01).不同剂量的病毒上清液经腹腔注入新生血友病B鼠后,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为(72.5±6.1)ng·mL-1,表达持续超过120d.治疗后小鼠的凝血功能均有一定程度的改善,以大剂量治疗组的改善最为明显,凝血活性提高至(3.4±1.5)%,APTT时间缩短至(43.6±7.2)s.hFⅨ的表达水平和凝血功能的改善程度与所用病毒的剂量呈正相关.治疗小鼠体内未检测到抗hFⅨ抗体,未发生任何治疗相关的毒副反应和生殖细胞的基因转移.研究结果表明,采用VSV-G假型反转录病毒开展新生血友病B小鼠invivo基因治疗是可供选择的有效方法.     

一种新型的低辅毒污染的重组AAV生产系统

将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中, 用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒. 在大量生产带有目的基因(EGFP, hFⅨ )的重组腺相关病毒载体的同时, 最大程度地限制了辅助病毒的产生, 从而减轻了下游纯化工作的压力. 活体动物实验的结果证实了这种方法的优越性. 实验结果为重组AAV载体系统在基因治疗领域中的应用提供了一条新的途径.     

小鼠乳清酸蛋白启动区指导人促红细胞生成素在转基因小鼠乳腺的表达

以小鼠乳清酸蛋白基因 (mWAP)调控区与人促红细胞生成素基因 (hEPO)构建融合基因 ,经动物个体暂态表达方法确证hEPO可在乳腺特异表达后 ,用显微注射方法将融合基因导入小鼠受精卵 ,再将受精卵移植到假孕小鼠 ,获得 86只G0 代小鼠 ,经PCR Southernblot及Southernblot证实 ,有 5 8只整合阳性小鼠 ,整合率为 6 7% ,ELISAkit,dotELISA等方法检测小鼠39只 ,有 1 6只表达阳性 ,乳汁中人hEPO的表达量高于 1 5 μg/mL .     

利用核糖体基因区打靶载体靶向表达改造型人凝血因子Ⅷ

构建了携带改造型hFⅧ(hFⅧ-BDDAK39)的核糖体基因区靶向表达载体pHrneo-BDDAK39, 并将其转入人纤维肉瘤细胞(HT1080), 检测其定点整合的能力及hFⅧ-BDDAK39的表达情况. 结果显示, pHrneo-BDDAK39能够成功地将hFⅧ-BDDAK39靶入到HT1080细胞的核糖体基因区, 定点整合效率达到2.0×10^-5, 并且靶入的hFⅧ-BDDAK39能有效表达, 表达量为(32±5)ng·10⁶细胞^-1·24 h^-1. 这为利用此靶向表达载体进行血友病A的基因治疗提供了重要的实验依据.     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

含有人凝血因子Ⅸ自身内含子Ⅰ的反向逆转录病毒载体构建及表达

目前基因治疗研究遇到的普遍问题是转染效率低下及目的基因蛋白在活体表达水平较低,其中解决目的基因表达较低的一个重要手段便是基因载体的改造。1990年,Jallat等人在转基因小鼠研究中发现:hFIX cDNA的表达量低,而其余一系列带有完整内含子Ⅰ或中间缺失4.8kb的内含子Ⅰ的转基因小鼠,其表达都和完整的Ⅸ因子表达相仿。这提示Ⅸ因子内含子Ⅰ顺序对其表达有一定的促进作用。1995年,Kurachi等人用含内含子Ⅰ片断的表达质粒转化HepG2细胞,发现瞬间表达要比cDNA高出7倍,其凝血活性和细胞内mRNA水平也有相应数量的提高。本实验室也进行了hFIX intron Ⅰ的研究工作,构建了逆转录病毒载体GlNaCi′IX,但对病毒上清进行RT-PCR检测,发现intron Ⅰ常被不同程度剪切。本文以SNMBAAIXm为蓝本,构建了反向表达载体GlNaPAi′IXBAM,其中Ⅸ因子转录方向与LTR转录方向相反,以期避免病毒包装中将intron Ⅰ剪切掉,使intron Ⅰ结构能够正确引入到靶细胞中,从而提高Ⅸ因子的表达量。     

含有人凝血因子Ⅸ自身内含子Ⅰ的反向逆转录病毒载体构建及表达

<正>目前基因治疗研究遇到的普遍问题是转染效率低下及目的基因蛋白在活体表达水平较低,其中解决目的基因表达较低的一个重要手段便是基因载体的改造。1990年,Jallat等人在转基因小鼠研究中发现:hFIX cDNA的表达量低,而其余一系列带有完整内含子Ⅰ或中间缺失4.8kb的内含子Ⅰ的转基因小鼠,其表达都和完整的Ⅸ因子表达相仿。这提示Ⅸ因子内含子Ⅰ顺序对其表达有一定的促进作用。1995年,Kurachi等人用含内含子Ⅰ片断的表达质粒转化HepG2细胞,发现瞬间表达要比cDNA高出7倍,其凝血活性和细胞内mRNA水平也有相应数量的提高。本实验室也进行了hFIX intron Ⅰ的研究工作,构建了逆转录病毒载体GlNaCi′IX,但对病毒上清进行RT-PCR检测,发现intron Ⅰ常被不同程度剪切。本文以SNMBAAIXm为蓝本,构建了反向表达载体GlNaPAi′IXBAM,其中Ⅸ因子转录方向与LTR转录方向相反,以期避免病毒包装中将intron Ⅰ剪切掉,使intron Ⅰ结构能够正确引入到靶细胞中,从而提高Ⅸ因子的表达量。     

分泌改善的重链促进基于蛋白内含子的双载体共转全长FVⅢ基因

在甲型血友病基因治疗中, 其疗效受FVⅢ的低分泌性和较大的FVⅢ基因难以为腺相关病毒(AAV)载体运载等因素的不利影响. 研究表明, 重链的分泌低下是导致FVⅢ分泌低效性的主要原因. 我们最近的研究表明, 应用蛋白质剪接技术的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因, 通过表达后重链和轻链的共价连接, 轻链可顺式促进剪接BDD-FVⅢ的分泌, 但重链分泌的低下影响分泌的水平. 本文将具有促进FVⅢ分泌作用的L303E/F309S点突变引入FVⅢ的重链, 通过蛋白质剪接的双载体共转断裂全长FVⅢ基因, 观察了重链和剪接全长FVⅢ的分泌和生物活性的变化. 构建了一对融合Ssp DnaB蛋白内含子(intein)的突变重链和轻链真核表达载体, 瞬时共转染培养的COS-7细胞, Western blotting结果表明转基因细胞有明显的剪接FVⅢ蛋白表达; 突变重链单独转基因后的分泌量为(39±11) ng/mL, 明显高于野生型重链的分泌量; 与轻链共转基因的重链分泌量增加到(123±13) ng/mL, 培养上清中分泌的剪接FVⅢ量和活性分别为(86±14) ng/mL和(0.61±0.08) IU/mL, 明显高于断裂的野生型FVⅢ共转基因. 另外, 转突变重链和轻链基因细胞的合并培养上清中亦检测到剪接的FVⅢ蛋白和生物活性, 且高于转野生型重链和轻链基因细胞的合并培养上清. 结果表明, 重链分泌性的改善可提高运用蛋白质剪接技术的双载体转断裂的全长FVⅢ基因的功效, 为动物体内进一步运用双AAV载体转全长FVⅢ基因提供了实验依据.     

乳腺表达人凝血因子Ⅸ的转基因小鼠的研究

通过正压手动显微操作技术,将能在离体细胞和活体细胞表达的人凝血因子Ⅸ的表达载体ｐＭＣⅨｍＤＮＡ导入５８６枚昆明白种小鼠受精卵,随后将显微注射后存活的４９９枚受精精卵移植于假孕受体母鼠,获得２１６只Ｆ０代仔鼠。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂产分析证实有６只仔鼠的基因组中有外源基因阳性整合,整合率为３％;ＥＬＩＳＡ测定２只Ｆ０代转基因雌鼠的乳汁中人凝血因子Ⅸ蛋白的含是均已达１００ｎｇ／ｍｌ一期法测定其     

黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

黄瓜花叶病毒(CMV)是一种正链RNA病毒,在全世界分布很广,至少可侵染85科365属中的757种植物.将经过改造的CMV复制酶基因导入植物,可获得比导入外壳蛋白基因等抗性水平高、时间长的工程植株.本文首次报道了中国株系CMV复制酶基因的克隆及其核苷酸序列,构建了3’末端不同长度缺失的植物表达载体.     

基因治疗——病笃投医

去年许多人曾预言,在1985年年底前将作基因治疗的临床试验。可是,基因治疗学家却遭到挫折,问题出在转移基因的反转录病毒的生物学。本刊本期刊登的霍克(Hock)和束勒(Miller)的论文对发展人类基因治疗的反转录病毒载体作出了进展,但却表明基因治疗依然渺茫(注1)。该文报道抗药基因转入了人体骨髓细胞。其重要性在于这是第一次在没有感染性辅助病毒存在的条件下成功地转移了基因;而且抗药基因在被转染的细胞中表达。独具匠心地设计和构建了这种反转录病毒载体,但在技术上还有些什么问题,投入应用的前景又如何呢?     

杆状病毒运载的乙型肝炎病毒表面抗原基因(preS2-S)在家蚕体内的高效表达

利用核型多角体病毒中多角体蛋白基因的强启动基因建立的表达载体系统,被认为是极有潜力的新型表达载体系统。我们组建了插入乙型肝炎病毒表面抗原基因(HBV preS2-S)的重组家蚕核型多角体病毒BmNPVS后,用重组病毒感染家蚕做了进一步的研究。发现在重组病毒感染的5龄蚕的血淋巴中每毫升含HBsAg 7-10μg,每条蚕的蚕体组织中还含     

利用ubi1内含子增强Bt cry1Ah基因在转基因玉米中的表达

Bt cry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌分离株BT8中鉴定克隆的新型杀虫蛋白基因. 本研究构建了两个含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体, 在其中一个植物表达载体(pUUOAH)的玉米Ubiquitin启动子与cry1Ah基因之间插入了玉米泛素蛋白基因ubiqutin1的第一个内含子(ubi1). 利用基因枪法将其导入玉米(Zea mays L.)胚性愈伤组织中, 得到了可育的再生植株. PCR及Southern blot检测结果表明, cry1Ah基因已整合入玉米基因组中, 并稳定遗传至下一代. 对T₁及T₂代转基因植株进行ELISA检测, 发现pUUOAH载体转基因植株Cry1Ah蛋白的平均表达量提高了20%. 对T₂代转基因植株进行了田间抗虫性鉴定, 发现转cry1Ah基因玉米对玉米螟有很高的抗性, 并且pUUOAH载体转基因植株的抗虫性好于pUOAH(无内含子)载体的转基因植株. 以上结果表明, 玉米ubi1内含子可以有效增强cry1Ah在转基因玉米中的表达.     

携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究

构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因（ｈⅨＲ３３８Ａ）及不同调控元件的腺相关病毒 表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后, 以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的ｒＡＡＶ/ＨＳＶ杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制 备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重 组病毒滴度达 １．２５ × １０１２病毒颗粒／ｍＬ,然后,利用这一重组病毒,对ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ进行离体及在体表达, 获得了 ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ在肌细胞系 Ｃ２Ｃ１２及血友病 Ｂ小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达（２５５１．３２± ９２．１４）ｎｇ·（１０６细胞）－１·（２４ｈ）－１及４６３．２８ｎｇ·ｍＬ－１,与野生型Ⅸ因子的表达水平（２５６５．７６±６４．３６）ｎｇ· （１０６细胞）－１·（２４ ｈ）－１及４５３．９２ ｎｇ· ｍＬ－１无显著性差异．然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的 ２．４６倍.．将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病 Ｂ基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装 系统──ｒＡＡＶ／ＨＳＶ杂合病毒包装系统──在重组ＡＡＶ载体大量制备中的应用     

基于氨基化SiO2纳米颗粒的新型基因载体

采用正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法, 制备了大小均匀的氨基化二氧化硅纳米颗粒. 由于表面氨基化使纳米颗粒在一定的pH环境下的x (zeta)电位为正值, 与带负电荷的质粒DNA通过静电结合能快速形成纳米颗粒-质粒DNA复合物, 并对结合的DNA有明显的保护作用. 结合纳米技术、生物技术与基因工程技术, 构建了基于氨基化SiO₂纳米颗粒的新型非病毒型基因载体, 应用这一新型基因载体成功地将绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)表达载体pIRGFP导入COS-7细胞, 并在细胞内产生高水平的绿色荧光蛋白表达.     

中国血友病B生物基因治疗研究状况

血友病B为一种严格的X连锁隐性遗传病, 由于其单纯的分子遗传基础和明确的临床表现, 容易观察疾病治疗的效果; hFⅨ较小的基因规模可以适用于几乎所有的常用基因载体系统. 在多种细胞均可以获得有效的表达使得基因治疗时可以有广泛的细胞选择范围, 同时也为生物工程制备重组蛋白药物提供了便利. 而且, 血友病B有天然和基因操作形成的动物模型便于治疗的临床前实验研究. 基于上述理由, 血友病B一直是遗传病基因生物治疗和重组蛋白药物制备的重要模型. 我国在20世纪90年代成功完成了基因治疗血友病B的临床试验, 对推进我国的基因治疗起到重要作用. 本文简述我国在血友病B的生物基因治疗方面的研究情况与发展方向, 希望为基因治疗和重组蛋白药物研究人员提供参考.