马铃薯卷叶病毒RT-PCR-RFLP的检测分析

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)是马铃薯生产上的主要病毒病原之一,侵染马铃薯后,造成减产和品质退化.采自云南、内蒙古和贵州的马铃薯样品经过DAS-ELISA检测为PLRV阳性,经RT-PCR扩增出约350 bp的DNA片段表明感染了马铃薯卷叶病毒.进一步用HaeⅢ和StuⅠ限制性内切酶对马铃薯卷叶病毒的RT-PCR产物进行Restriction fragment length polymorphism (RFLP)分析,RFLP图谱与预期图谱相符.证实RT-PCR-RFLP方法是1种快速、准确的检测方法.     

一种马铃薯病毒RT-PCR诊断新方法

对传统的植物病毒RNA苯酚提取法进行改进;同时设计并优化单管RT-PCR(O ne-tube RT-PCR)方法,使传统的RT-PCR两步反应在一个反应体系中同时进行,依据马铃薯Y病毒和马铃薯S病毒的基因组RNA保守序列设计2套特异性引物,采用上述新建立的检测方法对染病的马铃薯叶片组织进行病毒检测,结果与G eneB ank中报道的这两种马铃薯病毒核苷酸序列进行B last比较,同源性达到96%以上,用这种新型诊断方法对马铃薯病毒核酸进行了浓度检测,实验结果证明,这种新型马铃薯病毒诊断方法具有可靠、快速、简便等特点.     

马铃薯卷叶病毒基因组保守序列片段的RT—PCR扩增

从感染马铃薯卷叶病毒的植株中提取马铃薯卷叶病毒总RNA,针对马铃薯卷叶病毒基因组,其中的2个保守序列分别设计并合成了1对寡聚核苷酸引物,用反转录-聚合酶链式反应方法从提取的病毒RNA材料中扩增出符合设计大小的240bp、400bp的特异性产物,对照的健康植株中未扩增出相应产物。     

植物病毒RNA提取方法的研究

病毒RNA提取技术是分子生物学中经常应用的重要技术,是对RNA病毒在分子水平进行研究的必要手段.介绍了一种从染病植物组织中提取病毒RNA的方法,利用此方法提取了马铃薯x病毒(PVX)的RNA基因组,并通过RT-PCR得到其外壳蛋白基因,提取的病毒RNA在纯度和产量上都可满足反转录和PCR扩增等基本分子生物学操作.     

对虾桃拉病毒(TSV)RT-PCR快速诊断技术的研究

对虾桃拉病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)最早于1992年在凡纳对虾(Penaeus vannamei)体内发现，此病毒是对虾养殖业危害较严重的病毒之一．将该病毒基因组的一段序列克隆至转录载体pSP64(PolyA)上。经体外转录、磁珠法分离、纯化获得了人工的TSV-RNA模板；用定量的TSV-RNA阳性对照模板进行RT-PCR条件优化。灵敏度检测以及样品制备方法等试验，结果表明：RT-PCR检测的灵敏度可达到0．1fg，相当于100个病毒粒子；所制备的样品对病毒RNA的逆转录及扩增无抑制，适合于对虾桃拉病毒快速检测．     

葡萄病毒B优化检测体系的建立

为了解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题,为葡萄无毒化栽培的提供基本保障。本实验从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板进行一步RT-PCR扩增,并利用此扩增产物为模板进行二次扩增,二者均能获得与预期片段大小一致长约460bp和243bp的扩增产物,在此基础上,建立了萄病毒B的一步RT-PCR、巢式PCR以及斑点杂交优化检测体系。利用本实验所建立的优化检测体系对葡萄样本进行检测,表现出了良好的特异性与稳定性。     

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马…

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３＇端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行＾３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶ ＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测。结果表明，＾３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高。可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

高灵敏度巢式PCR方法扩增HBV全长基因组

探讨一种用于乙型肝炎病毒(HBV)基因组扩增的灵敏度高、广谱性好的巢式聚合酶链式反应(nested PCR)方法,适用于较低病毒拷贝数标本的HBV DNA扩增.通过设计两套通用巢式引物,实现对各基因型(A,B,C,D,E,G)HBV均具有较高的扩增效率;采用两步法分段扩增HBV基因组,对两段目的产物进行测序拼接获得HBV的全基因序列.应用本方法对4组病毒拷贝量(IU/mL)分别为:>1.0×104,1.0×103~1.0×104,2.0×102~1.0×103,<2.0×102的100份血清标本进行全长基因组扩增,其中75份获得阳性结果,各组阳性率依次为:100%,66.7%,60%,25%,有效扩增灵敏度为2.0×102~1.0×103IU/mL;而一步法只在病毒拷贝量>1.0×104IU/mL的标本组中获得15份阳性结果,总的阳性率仅为15%,说明该方法扩增灵敏度明显高于一步法.因此,本方法为HBV流行病学调查研究HBV基因组序列提供了更高的灵敏度,可在流行病学调查中发挥重要作用.     

猕猴桃褪绿环斑相关病毒RT-LAMP-LFD可视化检测方法的建立

猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot-associated virus, AcCRaV)是侵染猕猴桃的主要病毒之一.为实现对猕猴桃中AcCRaV的快速检测和监控,本研究建立了一种逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)结合横向流动试纸条(LFD)的检测方法,可实现快速、可视化检测猕猴桃中AcCRaV.本研究基于AcCRaV外壳蛋白基因保守区域,设计了一套LAMP特异性引物,优化后的反应体系在62℃恒温条件下,反应60 min,再进行5 min试纸条显色反应,即可完成样品的检测.检测灵敏性实验结果表明,建立的RT-LAMP-LFD方法具有较高的灵敏性,其检测灵敏度是常规RT-PCR的100倍.二者检测结果一致,LFD试纸条实现了检测结果的可视化.总之,该检测方法可为检测猕猴桃中AcCRaV感染状况提供了一种省时、高效的诊断方法.     

重庆市主栽优良甘薯品种的茎尖培养脱毒研究

选用重庆市大面积推广的优良甘薯品种进行茎尖脱毒离体培养试验，结果表明：对来源于薯块萌发芽的茎尖进行组织培养，其成苗率最高，达53.2％；连续两次进行茎尖培养可明显增强脱毒效果；对于甘薯病毒病的检测，反转录PCR法（RT-PCR）比硝化纤维素膜酶联免疫吸附检测法（NCM-ELISA）更灵敏和可靠。     

超低温保存脱除两种马铃薯病毒

采用超低温保存的方法对马铃薯病毒PVY和PVS进行了脱除研究.结果显示:经过超低温保存后,材料的存活率可达71.6%,比传统的茎尖培养脱毒材料的成活率在52%左右高;超低温保存后PVY病毒脱除率达到83%,比传统脱毒方法脱毒率(62%)和热处理脱毒率(65%)要高,且操作上也较简单;对于马铃薯PVS病毒脱除率在47%左右,而采用茎尖培养病毒的脱除率仅有17%左右.     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Barrett发表的犬瘟热病毒 (CDV)Onderstepoort弱毒株融合蛋白 (F)基因序列 ,设计合成了一对寡聚核苷酸引物 ,并以南京农业大学惠赠的Onderstepoort标准株反转录产物为模板 ,建立了CDV的RT PCR方法 ,并应用于CDV的诊断。结果表明 ,以该对引物 ,只能从CDV ONP标准株反转录产物中扩增出大小为 32 4bp的核苷酸片段 ,与理论设计值大小一致 ,而正常Vero细胞和同为副粘病毒科的新城疫病毒 (NDV)作为对照 ,病毒扩增结果为阴性。RT PCR可检出 1μl作 10 6倍稀释的CDV ONP标准株反转录产物 ,说明其具有很高的敏感性。应用试验结果 ,可从感染CDV犬的组织病料中提取RNA ,反转录产物中也扩增出 32 4bp的核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感性、特异性好的CDV的RT PCR检测方法 ,也为F基因的克隆和序列测定及表达奠定了基础。     

高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。     

用RT-PCR技术检测澳大利亚杏仁树李坏死环斑病毒

用RT-PCR技术检测澳大利亚杏仁树李坏死坏斑病毒,对92个待测样品的病毒．RNA进行扩增和检测,其中有79个呈阳性,表明检验样品的染病率较高．RT-PCR技术检测病毒的方法灵敏、准确,是检测苗木是否感染病毒的有效方法之一．     

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法 根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果 本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论 本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.     

乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法的建立

目的建立乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法,应用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。方法滴定病毒TCID50,筛选JEV敏感细胞,依据国标IFA法制备抗原片,并进行特异性、敏感性和稳定性试验。结果选取BHK21细胞作为JEV敏感细胞,病毒感染力滴度(TCID50)为10-8.9.mL-1;与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;稳定性和敏感性试验显示,不同时间IFA检测灵敏度均为1∶2560;可检测到的病毒滴度最低为10-6.5.mL-1。结论建立的IFA法敏感性、特异性强,稳定性好,可用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。     

两种方法检测汉坦病毒滴度的比较研究

【摘要】 目的：比较双抗体夹心ELISA法与直接免疫荧光(DFA）法在检测汉坦病毒灵敏度方面的差别。方法：用汉坦病毒76-118株感染Vero-E6细胞,取不同时间点的病毒感染细胞制备细胞爬片或细胞培养物冻融上清,分别用本室制备的抗汉坦病毒单克隆抗体标记荧光素或辣根过氧化物酶（HRP）建立直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测上述细胞中的病毒抗原,并比较两者的检测灵敏度,用空斑形成实验结果作为金标准,以评价两种方法在检测病毒抗原灵敏度方面的差异。结果: 用两种检测方法测定不同时间点的汉坦病毒培养物抗原,双抗体夹心ELISA法不仅检出的时间早,而且其病毒滴度均较IFA法高（P＜0.01）。结论：ELISA法检测汉坦病毒滴度的灵敏度较IFA法更高,并且操作简单,可重复性好,便于大批量规模化检测,因此更适用于汉坦病毒的检测。