盘基网柄菌肌球蛋白分子缺失对生长、发育的影响

将４种在盘基网柄菌肌球蛋白分子尾部不同部位缺失突变（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）的重链基因ＭｙａａΔ８２４－９４１,ＭｙａａΔ９３４－１４５４,ＭｙａａΔ９３４－１１９４,ＭΔ１１５７－１４５４,用标准电转化方法导入内源肌球蛋白重链基因封闭了细胞（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ Ｔ－ｎｕｌｌ ｃｅｌｌ）中表达,以野生型肌球蛋白重链基因细胞为对照,测试比较了     

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 10¹² vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 10¹¹ vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.     

抗CD20嵌合Fab′片段对B淋巴瘤细胞的生长抑制作用

利用PCR方法从抗CD20ScFv表达载体上扩增重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因,然后将VH,VL基因重组到Fab′表达载体中,构建成抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体pYZFcd20.用pYZFcd20转化大肠杆菌16C9,在16C9菌中分泌表达可溶性抗CD20Fab′片段,经分离纯化获得具有CD20抗原特异结合活性的嵌合抗CD20抗体Fab′片段.竞争性免疫荧光抑制实验表明,抗CD20Fab′片段能竞争性抑制亲本鼠源性抗CD20单克隆抗体HI47和Daudi细胞CD20结合.MTT法测定结果显示,抗CD20Fab′对Daudi细胞生长具有抑制作用.     

抗CD20嵌合Fab′片段对B淋巴瘤细胞的生长抑制作用

利用PCR方法从抗CD20ScFv表达载体上扩增重链可变区（VH）、轻链可变区（VL）基因,然后将VH,VL基因重组到Fab′表达载体中,构建成抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体pYZFcd20。用pYZFcd20转化大肠杆菌16C9,在16C9菌中分泌表达可溶性抗CD20Fab′片段,经分离纯化获得具有CD20抗原特异结合活性的嵌合抗CD20抗体Fab′片段。竞争性免疫荧光抑制实验表明,抗CD20Fab′片段能竞争性抑制亲本鼠源性抗CD20单克隆抗体HI47和Daudi细胞CD20结合。MTT法测定结果显示,抗CD20Fab′对Daudi细胞生长具有抑制作用。     

腺相关病毒外壳修饰与肿瘤靶向治疗

靶向性是肿瘤基因治疗取得成功的关键因素. 在众多基因治疗病毒载体中, 腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前广为关注的基因治疗载体系统. AAV具有广泛的宿主范围, 这也导致其缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高. 因此, 提高AAV载体在体内运输的靶向性和感染目的细胞的效率, 是实现AAV基因治疗的关键. 迄今为止, 科学家已开发出很多策略来改造腺相关病毒的外壳, 期望增强其靶向性或重靶向目的细胞. 这些策略不仅包括传统的化学修饰、噬菌体展示、外壳基因组改造和嵌合载体, 也包括新颖的标记营救、衣壳蛋白定向进化、AAV外壳直接肽段展示和AAVP (AAV-Phage)等. 本文评述了对AAV外壳改造达到靶向肿瘤细胞的研究进展.     

集胞藻PCC 6803中Ⅱ型RNA结合蛋白对于脂肪酸组成的效应

在集胞藻PCC6803中, Ⅱ型RNA结合蛋白基因rbp3在温度下降时仅有轻微上调. 与野生型相比, rbp3突变株中膜脂多不饱和脂肪酸(PUFA)总量显著减少. 但是, PUFA的减少并未达到影响其在低温下生长的程度. 突变株中的脂肪酸脱饱和酶基因desA, desB和desD, 以及在15℃生长所需要的基因ccr-1的mRNA显著减少, 而rbp1 (RNA结合蛋白1)和crhR (RNA解旋酶轻链)的mRNA不受影响. 因而, Rbp3可直接或间接地影响某些基因的mRNA水平.     

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒.     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

抑制CCoAOMT表达的转基因杨树的制浆性能

检测了生长3年的转反义CCoAOMT基因杨树(Populus tremula × Populus alba)的制浆性能. 该株系木质素含量比野生型对照下降约13%, G/S略有增加. 化学成分分析表明, 转基因杨树的灰分含量、冷水抽提物、热水抽提物、1% NaOH抽提物、综纤维素、戊聚糖及纤维素含量与野生型对照没有明显差别, 但转基因杨树的苯醇抽提物含量略有增加. 纤维特征分析表明, 转基因杨树的纤维品质有所提高. 实验室小规模制浆实验表明, 降低木质素含量可以明显改善转基因杨树的制浆性能, 表现为木质素更易于去除、纸浆得率增加和纤维聚合度提高.     

DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用

DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术, 自1994年提出以来, 经过了几十年的发展, 其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现. 腺相关病毒(adeno- associated virus, AAV)是一种细小病毒, 由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体. 但是AAV筛除存在一些不足, 如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展. 应用DNA 改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化, 有望解决这些问题. 本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用, 并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.     

腺相关病毒载体的靶向策略探讨

与其他病毒载体相比, 腺相关病毒(adenovirus-associated virus, AAV)由于具有宿主范围广、病原性低和携带的治疗基因表达期长等优势而成为目前最有前景的基因转移载体之一. 然而, 在临床基因治疗过程中, AAV具有广泛的宿主范围同时也导致缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高, 同时也缺乏安全性. 因此, 提高重组AAV (rAAV)的靶向能力对于基因治疗成功与否非常关键. 目前, 各种不同血清型AAVs的分离、鉴定、应用以及rAAV制备技术的发展使得rAAV载体可用于更多的临床基因治疗实验. 而且, 当前针对rAAV载体各种靶向策略的研究也显示了很好的基因治疗应用前景. 这些靶向策略主要包括转录靶向、受体靶向、共价偶联靶向、各种不同血清型AAV的应用以及基因重组靶向策略等. 本文就近年来基于rAAV载体的各种靶向策略的进展作一评述.     

在拟南芥中OsRAA1异位表达促进开花及下胚轴伸长

OsRAA1 (Oryza sativa root architecture associated 1)是拟南芥AtFPF1在水稻中的同源基因, 参与水稻根发育的调控. 将OsRAA1在拟南芥中异源超表达, 发现转基因拟南芥的开花时间提前, 同时发现在光照条件下转基因拟南芥的下胚轴长度增加. 进一步分析表明, 在蓝光、远红光和黑暗条件下转OsRAA1拟南芥下胚轴长度和野生型没有明显区别, 但在红光条件下, 转基因拟南芥的下胚轴长度是野生型的两倍. 转AtFPF1拟南芥也表现出类似的表型, 说明OsRAA1/AtFPF1蛋白不但可以调控拟南芥开花时间, 而且参与红光对下胚轴的光抑制过程, 它们在进化过程中保留了这两方面的功能.     

一种新型的低辅毒污染的重组AAV生产系统

将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中, 用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒. 在大量生产带有目的基因(EGFP, hFⅨ )的重组腺相关病毒载体的同时, 最大程度地限制了辅助病毒的产生, 从而减轻了下游纯化工作的压力. 活体动物实验的结果证实了这种方法的优越性. 实验结果为重组AAV载体系统在基因治疗领域中的应用提供了一条新的途径.     

非离子态氨对转“全鱼”生长激素基因鲤鱼的急性毒性和慢性毒性

在自然水体和人工水体中氨氮对鱼类是有毒的. 利用静水更新式生物测试研究了非离子态氨对转基因鲤鱼和对照鱼的96 h急性毒性实验和21 d慢性毒性实验. 通过96 h非离子态氨急性毒性实验发现, 转基因鲤鱼的非离子态氨氮24, 48, 72和96 h半数致死浓度(LC₅₀) (2.64, 2.44, 2.28和2.16 mg/L)分别比对照鲤鱼相应的24, 48, 72和96 h半数致死浓度(LC₅₀) (2.70, 2.64, 2.52和2.33 mg/L)略低, 没有显著性差异; 但在不同非离子态氨氮(3.86, 3.29和2.09 mg/L)胁迫下, 转基因鲤鱼的半数致死时间(LT₅₀) (1.41, 7.91和117.42 h)分别显著性短于对照鱼的半数致死时间(2.53, 14.06和150.44 h). 21 d非离子态氨慢性毒性实验发现, 在不同非离子态氨氮浓度(0.91 ± 0.12, 0.48 ± 0.06和0.12 ± 0.01 mg/L)胁迫下, 转基因鲤鱼的死亡率均显著性高于对照鲤鱼. 上述研究表明, 转基因鲤鱼对氨氮胁迫的耐受能力比对照鲤鱼差, 为客观评价转生长激素基因鲤鱼潜在生态风险, 并为今后确定转GH基因鱼集约化养殖的密度和制定养殖水体氨氮安全指标提供了重要的科学参数.     

转入生长激素基因红鲤F_2代阳性鱼的摄食及代谢研究

生长激素(GH)是由中腺垂体分泌的多功能激素,对动物生长的促进效应已无可置疑.将冠以小鼠重金属螯合蛋白(MT-1)基因启动顺序的人生长激素(hGH)基因重组质粒pMThGH显微注射到红鲫(Carassius auratus auratus)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)的受精卵内,获得了第一批转基因鱼,并进一步证实了转移基因的整合、表达、传代及转GH基因鱼的快速生长效应.由于鱼类自然群体中也存在个别的快速生长个体,对转GH基因鱼快速生     

类DnaJ蛋白基因sll1384参与集胞藻PCC 6803的趋光反应

在集胞藻PCC 6803中, 基因sll1384编码的蛋白在N端含有一个DnaJ结构域, C端含有一个TPR结构域. sll1384突变株对不同温度的适应能力同野生型没有区别, 但其趋光运动能力几乎丧失. 将野生型sll1384基因导入突变株后, 可恢复其向光运动. 电子显微镜观察发现, 突变株细胞表面的纤毛与野生型没有明显区别. 突变株的转化效率也与野生型相同, 推测Sll1384通过与其他蛋白相互作用调节集胞藻的趋光反应. 这是在蓝藻中发现的第一个影响趋光反应的类DnaJ蛋白基因.     

DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用

DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术,自1994年提出以来,经过了几十年的发展,其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现.腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)是一种细小病毒,由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体.但是AAV筛除存在一些不足,如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展.应用DNA改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化,有望解决这些问题.本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用,并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.     

人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因在烟草中共表达对棉铃虫有更好的杀虫活性

利用叶盘转化法获得了携带Cry1Ac, Cry1Ie和同时携带这两个基因的3种类型转基因烟草. 利用ELISA法测定转基因烟草叶片中Bt蛋白含量, 在携带两种Bt基因的转基因烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白分别占总蛋白的0.173%和0.131%. 在携带单个基因的烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白的含量分别为0.182% 和0.124%. 分别用野生型棉铃虫(Helicoverpa armigera)和Cry1Ac抗性棉铃虫的初孵幼虫在这3种类型的转基因烟草叶片上进行虫试, 并以未转基因烟草为负对照. 实验结果表明, 携带Cry1Ie基因的转基因烟草对这两种棉铃虫都有杀虫活性, 而携带Cry1Ac基因的转基因烟草仅对野生型棉铃虫有抗性, 携带两种Bt基因的烟草比仅含其中一个基因的烟草对这两种棉铃虫均有更好的杀虫效果. 该结果表明, 这两种Bt基因在转基因烟草中能够协同作用, 提高了烟草对害虫的杀虫效果. 同时, 转入两个Bt杀虫基因有可能成为延缓农业害虫对转基因作物产生抗性的新途径.     

腺病毒E1和E4区基因共存的细胞系的建立

腺病毒载体相对安全,能有效地将外源基因转导到培养细胞或动物细胞中,但仍存在装载容量不够理想和免疫原性两个缺点.尤其是后一缺点,已成为制约其应用于临床基因治疗的主要因素.据认为,E4区基因在免疫原性中起着关键作用.因此人们希望通过发展E4区和Ela共缺陷的腺病毒载体,以降低或消除腺病毒载体免疫原性.这首先需要建立E4和E1区共存的包装细胞系,以互补腺病毒载体上E4和E1区功能的缺失,完成腺病毒载体的复制和包装.但有文献认为E4区和E1a不能稳定地存在于同一细胞中.我们成功地将腺病毒的E4区(pJM17的9724bp EcoRⅠ—XbaⅠ片段)插入AAV(Adeno-associated virus,腺辅助病毒)载体pAAV/neo中,并转导进293细胞(来自腺病毒E1区转化的人胚肾细胞,含有E1a区)中,得到了E1和E4区稳定共存的G418抗性细胞系.结果说明,E1和E4区可以稳定地共存于同一细胞,有可能建立无或低免疫原性,外源基因装载量由8kb扩大到17kb的新一代腺病毒载体系统.另外也表明,AAV载体介导的外源基因大小至少可达12kb左右(E4区9.7kb neo基因2.7kb=12.4kb).     

阿维菌素B产生菌寡霉素合成阻断株的构建

以仅产阿维菌素(avermectin) B和寡霉素(oligomycin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)CZ8-73为出发菌株, 构建基因缺失载体pXL05(pKC1139∷ΔolmA1 + ΔolmA4), 并将其转入CZ8-73中, 通过缺失质粒和染色体之间的同源双交换, 对染色体上长达90 kb的寡霉素PKS基因簇(olmA)进行了缺失突变. 将4株经Southern杂交验证正确的基因缺失突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测, 发现4个突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B组分, 阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当, 说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成. 该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的, 不会发生进一步的重组, 因此突变株性状稳定, 在工业生产上具有应用价值.