HDAC抑制剂SAHA抑制人乳腺癌细胞MCF-7的迁移和增殖

用组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase complex,HDAC)抑制剂SAHA对人乳腺癌细胞MCF-7进行处理,抑制组蛋白的去乙酰化,进而检测SAHA对MCF-7的影响.体外划痕实验与Transwell实验表明SAHA可以抑制MCF-7细胞的迁移;免疫印迹(Western blot)实验表明SAHA可以抑制迁移相关基因MYL9蛋白水平的表达.MTT实验和克隆形成实验表明SAHA可以抑制MCF-7细胞的增殖;Western blot实验与逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验表明SAHA能够抑制细胞周期蛋白标志基因CyclinD1、CDK4的表达,促进周期蛋白激酶抑制剂p21的表达.     

植物蛋白乙酰化/去乙酰化与代谢和基因表达调控研究进展

植物细胞中组蛋白赖氨酸乙酰化修饰对基因表达具有重要的作用,同时影响糖酵解、三羧酸循环和光合作用途径中非组蛋白的代谢酶活性。因此,识别参与调控代谢酶活性的HAT和HDAC具有重要意义。相反,代谢物如乙酰-Co A和NAD+参与蛋白可逆乙酰化进程,并且它们在细胞内的水平可能影响组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的活性。从组蛋白质赖氨酸乙酰化可逆过程、蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶分类及其细胞内分布和代谢酶的活性研究阐述了HAT和HDAC的作用及其研究进展。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS275对HIV潜伏细胞株激活效应的初步研究

组蛋白的去乙酰化是造成HIV潜伏感染的主要影响因素之一.目前,开发潜在的组蛋白去乙酰化酶抑制剂用以清除HIV病毒潜伏库,是人们重要的研究方向.MS275是苯胺酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,已经被批准应用于临床抗肿瘤实验,但其是否具有抗HIV潜伏治疗作用仍未见报道.本研究以HIV-1潜伏细胞株A7为模型,通过流式细胞技术检测MS275药物的不同浓度、作用时间对HIV-1潜伏诱导激活效率的影响;通过CCK-8方法检测药物对HEK293及Jurkat细胞的毒性作用.结果显示,MS275化合物对HIV-1潜伏细胞具有激活作用,并表现出剂量和时间效应关系;与SAHA相比,MS275对细胞毒性更低.本研究提示MS275有望成为抗HIV-1潜伏治疗的候选药物.     

T细胞蛋白p80调控c-Myc表达的机理

为了解p80在正常T细胞以及T细胞癌变过程中的作用,在缺失p80的T淋巴瘤细胞中重新表达p80,其结果显示:原癌基因c-Myc的表达受到显著抑制,且细胞周期在G1期出现了停滞.定量PCR的结果表明:p80对c-Myc表达的抑制是转录水平的抑制.双荧光素酶报告基因试验表明:p80对c-Myc的抑制作用定位于c-Myc启动子上相对于转录起始位点的-1042bp～-630bp区域.运用TFSEARCH软件对这一区域的分析发现存在多个c-Myb结合位点.在稳定表达p80的T淋巴癌细胞中敲低c-Myb,表明p80对c-Myc的转录抑制是通过c-Myb来实现的.免疫共沉淀实验表明p80和c-Myb在细胞中存在相互作用.进一步的研究显示p80对c-Myc的转录抑制依赖于组蛋白去乙酰化酶的活性.研究结果表明p80有可能通过与c-Myb的相互作用将组蛋白去乙酰化酶募集至c-Myc启动子区域,并通过组蛋白的去乙酰化抑制c-Myc的表达.     

HDAC多靶点抑制剂在癌症治疗中的研究进展

在抗癌药物的研发中,组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)是极具研究前景的靶标之一.到目前为止,有5种HDAC抑制剂已被批准用于癌症治疗,并有多种HDAC抑制剂也正处于临床试验阶段.现已证实,多靶点抑制剂在预防、治疗和增强协同效应方面较单一靶点药物具有更大优势.本文针对抗癌药物领域,主要对已报道的HDAC多靶点抑制剂的设计思路和生物活性进行了综述.     

苯甲酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成及其抗肿瘤活性研究

以MS-275为先导化合物,设计并合成8个苯甲酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂,其结构经MS与1H-NMR确证。以MS-275为阳性对照药物,测试8个目标化合物对人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549的体外抗肿瘤细胞增殖活性,结果显示,合成的8个目标化合物中有6个化合物表现出较好的抑制肿瘤的活性,尤其是化合物5a与7b对肿瘤细胞的体外抑制活性与MS-275相比有较为显著地提高,可为进一步研究提供参考。     

青霉菌组蛋白去乙酰化酶基因的敲除及其次级代谢产物变化

丝状真菌尤其是青霉菌Penicillium代谢的各类次级产物日趋成为研制新药的重要来源，很多药物如抗癌药物、抗生素、免疫抑制剂等均来源于真菌。然而真菌次级代谢受多因素的影响，其中表观遗传修饰起到重要的调控作用。组蛋白乙酰化表观遗传修饰常与转录激活相关，从而促进次级代谢产物的合成。以青霉属真菌Penicillium christenseniae SD-193.84为研究对象，利用生物信息学手段确定其组蛋白去乙酰化酶（HDAC）基因，建立该菌中同源重组基因敲除技术，对该基因进行敲除，并比较了基因敲除前后次级代谢产物的变化，发现HDAC影响了多种次级代谢产物的合成。本研究为青霉菌分子遗传操作及次级代谢调控提供了参考。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂：阻滞肿瘤细胞生长

由中科院广州生物医药与健康研究院“关于组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研究”取得了重要进展。该研究成功地构建了天然环肽Largazole与组蛋白去乙酰化Ⅰ型酶的结合模型，以计算机辅助药物设计的方法成功设计合成了一系列全新的环肽。其中化合物7有效抑制HT-29肿瘤细胞的生长（G150=50nM），     

酿酒酵母组蛋白H3K14乙酰化对H3K4三甲基化的影响

首先构建酿酒酵母BY4741组蛋白H3第14位赖氨酸突变菌株,该位点突变后则不能被乙酰化.然后通过Western blot检测突变菌株和未突变菌株(对照菌株)的H3K4三甲基化.结果表明,H3K14突变菌株中未检测到H3K4三甲基化,而作为对照的未突变菌株能够检验到H3K4三甲基化修饰.该结果显示酿酒酵母组蛋白H3K14乙酰化能够对H3K4三甲基化产生影响.     

N-(2-氨基苯基)-4-[N-(苯丙烯酰)氨基]苯甲酰胺的合成及体外抗肿瘤活性

合成了系列苯甲酰胺(3a-3j)类组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi).采用MTT法检测了3a-3j对MCF-7、HeLa和A549细胞株的体外细胞毒性,采用荧光分析法测定了3a-3j对HDAC的抑制作用.结果表明:N-(2-氨基苯基)-4-{N-[(2-氯苯基)丙烯酰]氨基}苯甲酰胺(3b)和N-(2-氨基苯基)-4-{N-[(2-硝基苯基)丙烯酰]氨基}苯甲酰胺(3e)表现较高的活性,对HDAC的IC50值分别为7.71和3.5μmol/L,与西达苯胺(2.7μmol/L)相当;3b对MCF-7、HeLa和A549细胞株的IC50值分别为6.5、6.0和5.6μmol/L,3e对MCF-7、HeLa和A549细胞株的IC50值分别为3.9、3.1和2.9μmol/L,与MS-275(3.5μmol/L)相当.     

水稻组蛋白脱乙酰化酶HD2 HDACs蛋白质的生物信息学分析

HD2 HDACs家族成员是植物特异性的组蛋白脱乙酰化酶并参与基因的转录调控.本研究利用生物信息学方法对水稻组蛋白脱乙酰化酶HD2 HDACs家族成员(HDT701、HDT702、HDT2201和HDT2202)的生物学功能进行研究.结果表明,HD2 HDACs家族成员位于不同的染色体上,分布于细胞的不同部位;它们编码的蛋白均含有依赖于cAMP-和cGMP的蛋白激酶、蛋白激酶C、酪蛋白激酶II与酰胺化4个相同的位点;它们均无跨膜区,都为不稳定的亲水性蛋白质,都无信号肽.多序列比对发现粳稻与籼稻HD2 HDACs的同源性非常高;水稻HD2 HDACs蛋白质的结构域比较特殊;这些蛋白可能参与植物的基因复制、信号传导、转录过程和免疫应答等过程.     

组蛋白去乙酰化抑制剂对拟南芥根尖干细胞微环境的影响

根系发育是植物生长的重要组成部分,该过程由多种信号转导途径共同调节。组蛋白乙酰化和去乙酰化的动态变化对基因表达具有关键的调控作用,而对其在根发育中功能的研究还不深入。本研究通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A（TSA）处理拟南芥,发现其主根生长受到抑制,分生区细胞数目变少。显微观察的结果表明TSA影响了根尖干细胞微环境。根尖微环境调控相关因子SCR和SHR的表达受TSA处理的影响并不明显,而PLT1/PLT2的表达受TSA强烈抑制。我们对生长素运输途径的分析发现在TSA处理条件下,PIN1表达只受轻微影响,而PIN2表达量明显下调。pDR5:GFP的结果表明TSA可能引起生长素在根尖的积累和分布变化。综上所述,TSA影响了拟南芥根尖干细胞微环境的维持,表明组蛋白的去乙酰化在根发育过程中发挥着重要作用。     

SIRT1与乙酰化底物、NAD+或烟酰胺的相互作用

沉默信息调节因子2相关酶1 (SIRT1)是一类腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性去乙酰化酶.烟酰胺是SIRT1催化的去乙酰化反应的产物,也是SIRT1的一种非竞争性抑制剂.利用蛋白同源模建和分子对接方法构建了“SIRT1/NAD+/p53乙酰化多肽”和“SIRT1/ADPR(二磷酸腺苷核糖)/烟酰胺”的两种复合物结构模型.根据“SIRT1/NAD+/p53乙酰化多肽”的复合物模型,发现SIRT1的265位丝氨酸(S265)和346位天冬酰胺(N346)与NAD+有相互作用,275位丝氨酸(S275)位于NAD+结合口袋的入口处.通过酶动力学实验证明:将S265、N346和S275突变之后会降低甚至消除NAD+与SIRT1的相互作用.另外,根据“SIRT1/ADPR/烟酰胺”的复合物模型,烟酰胺的酰胺基团与347位异亮氨酸(I347)、348位天冬氨酸(D348)形成了氢键,同时其嘧啶环埋在由262位丙氨酸(A262)、270位异亮氨酸(I270)、273位苯丙氨酸(F273)、316位异亮氨酸(I316)和347位异亮氨酸(I347)所包围的疏水环境中.将I316突变成丙氨酸,提高了酶与烟酰胺的结合能力,也显著提高了烟酰胺的抑制活性,这一现象表明烟酰胺结合在SIRT1的C口袋处.     

HDAC1重组腺病毒载体的构建及鉴定

利用Ad-Easy腺病毒表达系统构建含有人源性组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因的重组腺病毒,并检测其在脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)中的表达及对h UC-MSCs增殖的影响.RT-PCR扩增人HDAC1 ORF序列,构建p Ad Track-CMV-HDAC1重组腺病毒穿梭质粒,Pme I单切后将其转化进入E.coli BJ5183与腺病毒骨架质粒同源重组,Pac I单切线性化后转染至HEK293细胞中扩增和包装p Ad-HDAC1,采用空斑法鉴定病毒滴度;p Ad-HDAC1感染h UC-MSCs,倒置荧光显微镜下观察荧光表达,qRT-PCR和Western Blot分别检测细胞中HDAC1在mRNA水平和蛋白水平的表达,CCK-8实验检测HDAC1高表达对h UC-MSCs增殖的影响.结果显示成功扩增人HDAC1 ORF序列并构建p Ad-HDAC1重组腺病毒;病毒感染后h UC-MSCs中HDAC1 mRNA和蛋白表达水平明显增高,并且促进h UC-MSCs的增殖.成功构建HDAC1高表达的腺病毒,可有效提高h UC-MSCs中HDAC1的表达并促进细胞增殖.     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

EBNA1 和Vav1 共同调控Bim表达影响细胞凋亡的研究

Burkitt's淋巴瘤是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤,主要发生在非洲赤道地区,病理特征表现为颌部或腹部肿大成瘤.在我国广东地区发病率较高,目前治疗效果较差.发现在Burkitt's淋巴瘤细胞Raji中EBNA1和Vav1蛋白可以影响Bim的表达和细胞凋亡.组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB)刺激Burkitt's 淋巴瘤Raji 发现促凋亡蛋白Bim表达上调.进一步实验发现病毒蛋白EBNA1和细胞蛋白Vav1的共表达可以抵消NaB对Bim启动子转录活性的影响. 因此,认为EBNA1 和Vav1 蛋白具有协同作用,共同调控组蛋白的乙酰化水平影响细胞凋亡.     

乙酰基转移酶TIP60蛋白乙酰化位点定位的研究

乙酰基转移酶TIP60(tat-interaction protein,60ku)介导众多蛋白的乙酰化修饰,如核心组蛋白、p53、ATM、H2AX、RB和E2F1等,参与调控细胞凋亡、周期阻滞、DNA损伤修复和细胞衰老等多种重要细胞生理活动,并且与肿瘤发生密切相关.与另外2种乙酰基转移酶p300和PCAF相似,TIP60也可以介导自乙酰化.目前,TIP60自乙酰化修饰的精确位点和细胞功能并不清楚,因此在体外条件下,对TIP60蛋白的乙酰化位点进行了初步定位.构建了4种GST-TIP60原核表达质粒,利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达型菌株BL21系统,诱导表达并纯化含有TIP60全长和不同片段的GST融合蛋白,通过体外乙酰化实验证实TIP60蛋白的乙酰化位点集中在N端,而不是含有保守的MYST结构域的中间段.这些实验结果为进一步研究TIP60自乙酰化调控方式及其对TIP60蛋白细胞功能的影响提供了必要条件.     

Trichostatin A能导致小麦基因组DNA改变及甲基化修饰

为了研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂的作用机制,本实验以组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A处理小麦根尖,通过随机扩增多态性DNA标记技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)和双限制性内切酶酶切-随机扩增法(Coupled Restriction Enzyme Digestion-Random Amplification,CRED-RA)进行探究的结果发现,与对照组相比,处理组10个随机引物的RAPD扩增条带出现83条多样性差异,多样性比例达到87.4%,同时处理组DNA甲基化比例增加.本研究证实Trichostatin A能使小麦基因组DNA发生改变,并出现了表观修饰,从而从分子和表观水平探讨了该抑制剂的作用机理.     

线粒体去乙酰化酶SIRT3与衰老疾病

线粒体去乙酰化酶SIRT3是酵母Sir2同源蛋白,通过对线粒体多种蛋白质赖氨酸的去乙酰化修饰,它可以调控多种代谢过程,如脂肪酸的β-氧化作用、TCA循环、氧化磷酸化等.SIRT3可参与氧化应激反应,降低细胞内ROS水平;也可以作为一种肿瘤抑制因子,促进细胞的凋亡.在某些乳腺癌细胞中,SIRT3表达下调.敲除SIRT3或者SIRT3表达降低,可影响与代谢相关的衰老性疾病如心脏疾病、癌症等的发生.论文总结了近年去乙酰化酶SIRT3在代谢调控及癌症细胞凋亡中的分子机制以及SIRT3与心脏疾病、癌症的相互关系,希望为衰老疾病的预防和治疗提供一定的理论基础.     

组蛋白H3K36位点甲基转移酶识别组蛋白底物的分子机制研究进展

组蛋白H3第36位赖氨酸的甲基化修饰在染色质上含量丰富,与活跃转录以及DNA损伤修复等重要生理过程相关．H3K36位点可以被一甲基化、二甲基化和三甲基化3种形式修饰,目前已知的负责组蛋白H3K36三甲基化修饰的人源蛋白是SETD2,负责组蛋白H3K36二甲基化修饰的酶包含NSD1、NSD2和NSD3和ASH1L共4名成员．这些H3K36甲基转移酶都具有非常特异的H3K36位点选择性,因此,对调控体内H3K36甲基化修饰的水平和分布十分重要．此外,它们的表达异常与人类的多种疾病相关．因此,解析组蛋白H3K36甲基转移酶识别并修饰组蛋白底物的分子机制,对揭示这些酶参与的表观遗传调控机制及其在体内的生理功能都具有十分重要的意义．早期的研究使得人们对组蛋白H3K36甲基转移酶催化底物的机制有了较深入的认识,但是由于解析的修饰酶与底物复合物的结构较少,对这些酶特异识别组蛋白底物分子机制的认识尚有很多不足．近年来,随着冷冻电镜技术的应用,H3K36甲基转移酶与核小体底物的复合物结构相继取得了突破,极大地推进了人们对这些酶识别并催化组蛋白底物分子机制的认识．本文以这几个组蛋白H3K36甲基转移酶为主要目标,对其分子机制的最新进展进行介绍总结．