水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

拟南芥锌指结构域ABRv1基因的功能研究

为了分析拟南芥脱落酸响应蛋白RING-V1基因(ABRv1)的功能,构建了高表达载体pBI121-ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1.通过DNA及RNA水平鉴定了ABRv1基因的T-DNA插入突变体abrv1.对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,突变体的萌发率不足10%,野生型萌发率为40%,而过表达株系萌发率为67%;突变体株系气孔几乎全部关闭,过表达株系气孔关闭不明显,大小是突变体株系的2~3倍.结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用.     

一株拟南芥晚花突变体的分子分析

植物的开花时间直接控制植物营养生长期和生育期的长短,在相当程度上决定着繁育的成功与否,也与植物的产量和质量性状密切相关.拟南芥花期改变突变体是植物开花调控机制研究重要的植物材料.研究利用前期研究中获得的一株稳定遗传的、晚花表型的T-DNA插入拟南芥突变体pex2为材料,对其进行开花相关表型分析、T-DNA插入位点鉴定及插入位点基因转录分析等研究,结果表明:pex2突变体中存在单一的T-DNA插入,该插入位点位于PEX2基因下游约1 800 bp处,且该位点的插入引起了PEX2全长转录产物的缺失.该研究为进一步探索pex2突变体晚花机制及拟南芥PEX2基因与晚花表型之间的相关性研究,提供了研究材料.     

拟南芥AtHHR2基因的功能初步研究

为了研究拟南芥Highly Homologous RING domain 2基因(At5g43200)在盐胁迫逆境的功能,通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T-DNA插入突变体athhr2,并通过根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得了athhr2/ATHHR2互补转基因株系.对突变体、互补转基因株系及野生型进行盐胁迫处理,对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测,发现盐处理后缺失突变体的萌发率降低,脯氨酸和叶绿素含量低于野生型,互补株系的萌发率、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型.以上结果证明AtHHR2基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控作用.     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用

目的:设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.方法:采用生物信息学网站设计靶向c-myc基因的gRNA,以GFP作为对照设计GFP gRNA;通过T7E1筛选出编辑效率高的gRNA并将筛选的gRNA构建CRISPR/Cas9腺病毒载体并包装腺病毒,通过分析细胞增殖、周期和凋亡及迁移能力的变化来评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.结果:成功设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统能够显著抑制Hepa1-6细胞的增殖和迁移、阻滞细胞周期进程,但对细胞凋亡无影响.结论:靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统可在细胞水平明显抑制肝癌细胞的生长.     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

一株拟南芥镉敏感突变体的筛选及表型分析

利用不同浓度梯度的CdCl2对拟南芥Col-0生态型进行处理,确定了筛选镉敏感突变体的适合浓度为90μmol/L.以镉对幼苗根长生长抑制程度为指标,对拟南芥化学诱导激活标签(XVE)T-DNA插入突变体库种子进行筛选.首先在不含有雌激素的1/2MS培养基进行大规模筛选,挑选根长抑制明显的植株,单株收取种子.在T3代复筛过程中用含有浓度为90μmol/L CdCl2的1/2 MS固体培养基筛选到一株敏感突变体csr-2.并进行了雌二醇诱导过表达表型验证.运用TAIL-PCR技术确定该植株的T-DNA插入位点位于At2g36130,并对该基因的序列进行了初步的生物信息学分析.     

拟南芥活性氧响应基因GDI功能初步分析

从拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA插入突变体库中筛选分离到活性氧敏感突变体gdi并克隆出相应基因GDI,生物信息学分析发现该基因具有多个ABA及氧化胁迫相关顺式作用元件,定量PCR及GUS染色结果表明该基因主要在花器官中表达,激光共聚焦实验显示GDI蛋白在细胞质中广泛分布.     

利用CRISPR /Cas9技术快速创制香型“秀水134”水稻

以目前上海市主栽的高产常规水稻"秀水134"为材料,利用CRISPR/Cas9技术成功敲除甜菜碱醛脱氢酶2基因,获得了两种类型纯合突变体植株.采用表达载体特异性结合的引物检测T_1代转基因植株,成功获得6株不携带载体骨架的转基因植株.定量PCR分析显示,突变体植株甜菜碱醛脱氢酶2基因表达量极显著低于野生型对照(p0.01),但突变体植株成熟种子香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)含量极显著高于野生型对照(p0.01).比较野生型对照与突变体植株的主要农艺性状和产量性状,两者间都没有显著差异(p0.05).本研究可为加快高产香型水稻在上海及周边地区的推广应用,以及为今后利用CRISPR/Cas9技术快速培育其他高产香型水稻新品种研究奠定基础.     

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼核受体PXR基因初探

孕烷X受体(Pregnane X receptor,PXR)是核受体超家族(NRs)中NR1I的重要成员之一,在保护机体免于内源性和外源性物质损伤方面具有重要作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立PXR基因敲除的斑马鱼模型,为研究环境污染物的毒性机理及代谢过程提供基础模型。根据PXR基因序列,设计gRNA靶位点,体外转录合成gRNA。同时,将设计合成的gRNA与Cas9 mRNA通过显微注射转入斑马鱼受精卵,经孵化、筛选出有效的突变体,并逐代培养杂交筛选出PXR基因敲除突变体。结果表明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除PXR基因,经测序分析获得稳定的PXR(+4/+4)基因纯合体。     

拟南芥角果角度相关基因SPA的分子鉴定与功能分析

利用T-DNA插入突变的方法从拟南芥中筛选得到1个角果果柄生长角度变小的突变体,克隆得到该突变基因为SPA基因,并利用PCR和RT-PCR方法验证了T-DNA的插入位点;将SPA基因转入spa突变体后,互补植株角果角度恢复到野生型水平．推测SPA基因可能在调控角果角度方面具有重要功能．关键词 拟南芥;角果角度;SPA基因;TAIL-PCR     

拟南芥RING finger结构域ABRv1基因的功能初步研究

拟南芥ABscisic acid responsive RING-v protein 1基因（ABRv1）编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶。为了分析ABRv1的基因功能,我们首先构建了高表达载体pBI121- ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1。通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T –DNA插入突变体abrv1。对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,检测其萌发率、气孔关闭情况进行,发现ABA处理后突变体的萌发率降低,过表达株系萌发率升高;突变体株系气孔几乎未关闭,过表达株系气孔关闭非常明显。以上结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用,为深入分析该基因的功能打下基础。     

油菜突变体库构建与激素反应基因克隆分析

以优质高产的油菜品种1244W6为材料,采用浸花蕾方法,将含有激活标记和Basta筛选标记质粒pSKI015的农杆菌进行转化,成功构建了油菜激活标记突变体库.通过Basta筛选,结果共获得约30 000个转基因株系(T1代).将部分转基因株系种子(T2代)培养在不含任何激素、或含有不同浓度植物激素的营养液中,结果筛选出激素反应突变体63个,长下胚轴和短下胚轴突变体分别为15和13个.采用TAIL-PCR技术,克隆了W1016激素反应突变体T-DNA插入位点基因组旁邻序列.     

拟南芥低光效突变体lpe1的筛选和特性分析

利用叶绿素荧光仪对化学诱变剂乙酰甲基磺酸(EMS)诱变的野生型拟南芥(Col-0生态型)F2代幼苗进行叶绿素荧光突变体筛选,获得了一株低光合效率突变体lpe1(low photosynthetic efficiency 1).遗传分析结果表明,lpe1是一个单基因隐性突变体.在生长发育的各个时期,lpe1叶片的叶绿素荧光值、叶绿素含量、淀粉含量和总蛋白含量明显低于野生型.     

缺失AtArm基因导致拟南芥耐热性下降

生物信息学数据表明,At3g09350基因编码一种受高温诱导的armadillo,beta-catenin repeat蛋白,但其生物学功能迄今不详,我们利用基因组DNA PCR、RT-PCR和Western-blotting方法,对该T-DNA插入拟南芥突变体进行了筛选,获得At3g09350基因被敲除的T2代纯合突变体,通过表型分析,我们发现,该突变体的获得耐热性明显下降,呈现热敏感表型.分子进化分析结果表明,该基因为微牛物和动物Hsp70s的核苷酸交换因子的同源物,它的缺失可能导致Hsp70s分子伴侣活性下降,进而导致拟南芥耐热性下降.     

靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接，构建CREPT基因敲除质粒；体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体；体外切割实验结果显示，以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

一株晚花和镉敏感拟南芥突变体的分离与鉴定

为了进一步挖掘拟南芥响应Cd胁迫的分子机制,从化学诱导型拟南芥突变体库(约6 000株系)中筛选获得Cd敏感突变体,通过测量经Cd处理后拟南芥植株的根长变化获得Cd响应突株系,然后单株收种并鉴定,最终获得一株对Cd胁迫敏感的突变体。Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)发现这株突变体T-DNA的插入定位于基因At1g35820和At1g35830之间。进一步分析表明这个突变体也是FLC(Flowering locus C)依赖的晚花突变体,将这株突变体命名为fcr(flowering and cadmium related gene)。FLC在拟南芥开花调控网络中起枢纽作用,并且是开花正调控基因Suppressor of overexpression of co 1 (SOCI)的抑制因子。在该突变体中FLC的表达明显高于野生型植株,而FLC下游基因SOCI的表达明显低于野生型植株,但FLC上游基因的表达变化不明显。进一步实验发现,突变体fcr中调节环境因素和春化作用的基因High expression of osmotically responsive gene 1(HOS1)表达量显著增加。通过以上结果我们推测,突变体fcr中的晚开花和Cd敏感表型可能是HOS1基因过量表达所致。     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。