不同抗性棉花品种PR基因响应大丽轮枝菌的表达分析

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病每年给我国农业生产造成严重经济损失。为了明确不同抗性陆地棉(Gossypium hirsutum)品种中病程相关基因(GhPR基因)响应不同致病型大丽轮枝菌的表达差异,揭示GhPR基因在棉花与大丽轮枝菌互作过程中的免疫反应变化,本研究用寄主来源的棉花黄萎病菌落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6以及非寄主来源的落叶型菌株S1和非落叶型菌株V31分别对2个感病棉花品种和1个抗病棉花品种的无菌根系进行诱导处理,检测GhPR基因的表达情况。结果显示,棉花黄萎病菌落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6均能诱导3个棉花品种的GhPR基因普遍上调表达;在感病品种军棉1号上,2个菌株诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数相当;在感病品种新陆早1号上,I6菌株诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比V592菌株多;表明在棉花感病品种上,非落叶型菌株诱导GhPR基因上调表达的能力与落叶型菌株的诱导能力相当,甚至更强。在抗病品种中植棉2号上,落叶型菌株V592诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数及上调表达量均显著高于I6菌株诱导的上调表达量,表明在棉花抗病品种上,落叶型菌株诱导GhPR基因上调表达的能力比非落叶型菌株的诱导能力强。对非寄主来源的2个大丽轮枝菌菌株,非落叶型菌株V31诱导感病棉花品种GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比落叶型菌株S1多,落叶型菌株S1诱导抗病棉花品种GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比非落叶型菌株V31多。结果表明,棉花感病品种的GhPR基因对落叶型和非落叶型大丽轮枝菌侵染均有一定的响应能力,棉花抗病品种的GhPR基因对落叶型菌系侵染具有更强的响应能力。     

不同寄主大丽轮枝菌培养性状的比较及致病力分化的分析

为了明确不同寄主来源大丽轮枝菌培养性状的差异及致病类型的分化,本研究对分离自6个寄主的8个大丽轮枝菌菌株通过PDA培养性状、产孢量和孢子萌发率的测定对其生物学性状进行了比较,对4种碳源和氮源的利用对8个菌株的营养需求进行了分析,并通过致病型和生理小种的分子鉴定及对棉花的致病力,对8个菌株的致病力分化进行了研究。培养性状结果表明:5个菌株形成菌核型菌落,3个菌株形成中间型菌落,且菌株之间的培养性状存在明显差异。产孢量和孢子萌发率的结果显示:红花上的Vnu菌株产孢量和孢子萌发率都明显高于其它菌株,具有最强的繁殖力,而番茄上的Vtr菌株的产孢量最低,马铃薯上的S2菌株的孢子萌发率最低,表明各菌株具有不同的繁殖力。对碳源和氮源的利用表明:各菌株对不同种类的碳源和氮源的利用存在明显差异,其中Vtr菌株对所有供试碳源和氮源的利用能力最好,向日葵上的S1对4种碳源的利用最差,表明菌株之间具有不同的碳氮源需求。致病型和生理小种的分子鉴定表明:Vnu为1号小种,除Vtr之外其他菌株均为2号小种,并且只有鉴定为2号小种的菌株才可以进一步分为落叶型和非落叶型;所有供试菌株均能侵染棉花引起黄萎病,马铃薯上的S2菌株和茄子上的S3菌株对棉花的致病力比棉花黄萎病菌V592强,其他菌株对棉花的致病力明显比V592菌株弱,且发病延迟,表明8个菌株致病力分化明显。     

大丽轮枝菌响应赤霉素基因差异表达分析

为初步明确大丽轮枝菌响应赤霉素的机理,利用野生型大丽轮枝菌菌株V592为材料,用0. 1μmol·L~(-1)植物来源的GA_3进行处理,3 h后收集样本,利用RNA-Seq技术进行转录组分析,以期筛选和明确大丽轮枝菌响应GA_3的差异表达基因及代谢通路。通过Illumina测序,得到大丽轮枝菌10924条功能基因,其中161个为显著差异表达基因(DEGs),包括70个上调基因,91个下调基因;采用GO、KEGG注释库分别对161个基因进行功能注释,发现主要涉及次级代谢产物合成,丙酮酸代谢、二羧酸代谢,生物合成抗生素和碳代谢等相关通路。本研究为进一步解析大丽轮枝菌响应外源植物激素GA_3分子机制奠定了一定基础。     

大丽轮枝菌微菌核形成的影响因素研究

为了研究大丽轮枝菌微菌核形成的影响因素及其与微菌核形成相关基因之间的关系,本研究通过微菌核形态观察、重量测定及形成相关基因的表达测定,对不同温度、光照、营养及寄主根系诱导条件下,棉花大丽轮枝菌V592菌株微菌核的形成进行了分析。结果表明:以PDA为基质,26℃比22℃更有利于微菌核形成;连续黑暗的条件比自然光及连续光照更有利于微菌核形成;营养丰富的全营养PDA培养基比半营养PDA及水琼脂平板更有利于微菌核形成;棉花根系及其提取物对微菌核的形成具有促进作用。通过q RT-PCR对7个微菌核形成相关基因的表达量进行测定,结果显示,温度、光照及营养条件改变后12 h,7个基因在26℃时的表达量明显高于22℃时的表达量,6个基因在黑暗中的表达量明显高于连续光照条件下的表达量,6个基因在全营养中的表达量明显高于营养缺乏的培养基中的表达量,表明大丽轮枝菌微菌核的产量与温度、光照和营养条件改变后12 h各基因的表达量密切相关。而寄主根系对微菌核形成相关基因的表达在12 h时有短暂的抑制作用,但是48 h后各基因不断被诱导表达。以上结果表明大丽轮枝菌微菌核的产量与微菌核形成相关基因的诱导表达密切相关。     

大丽轮枝菌VDmef2基因抗逆及致病相关性分析

【目的】分析转录因子VDmef2在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中的功能。【方法】通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因重组法获得了VDmef2基因的定点敲除突变体,然后分析了该突变体在不同碳源及逆境条件下的表型以及大丽轮枝菌在MIM培养基上微菌核的形成情况,还分析了大丽轮枝菌对陆地棉(Gossypium hirsutum)的致病力。【结果】大丽轮枝菌转录因子VDmef2定位于细胞核。VDmef2基因突变后,大丽轮枝菌微菌核形成能力降低,同时对H_2O_2更加敏感,也丧失了对陆地棉的致病力。【结论】转录因子VDmef2与大丽轮枝菌微菌核形成、耐氧化及致病力有关。     

棉花变黑轮枝菌的鉴定及致病性的测定

自湖北棉区有黄萎病症状的棉叶中分离到能产生厚垣孢子的褐色菌,取2个供试菌株V12和V24,经形态特征、生物学特性和ITS分析,鉴定为变黑轮枝菌(V.nigrescens).对其致病性进行测定,发现其对棉花致病力极弱.推测该菌是一种植物衰老期或植物生长势呈下降趋势时的病原菌,常与大丽轮枝菌混生.     

大丽轮枝菌VDmef2基因抗逆及致病相关性分析

【目的】分析转录因子VDmef2在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中的功能。【方法】通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因重组法获得了VDmef2基因的定点敲除突变体,然后分析了该突变体在不同碳源及逆境条件下的表型以及大丽轮枝菌在MIM培养基上微菌核的形成情况,还分析了大丽轮枝菌对陆地棉(Gossypium hirsutum)的致病力。【结果】大丽轮枝菌转录因子VDmef2定位于细胞核。VDmef2 基因突变后,大丽轮枝菌微菌核形成能力降低,同时对H2O2更加敏感,也丧失了对陆地棉的致病力。【结论】转录因子VDmef2与大丽轮枝菌微菌核形成、耐氧化及致病力有关。
     

大丽轮枝菌淀粉酶VdAmy-1的致病功能

大丽轮枝菌是引起棉花黄萎病的病原菌,其分泌蛋白是侵染寄主的主要作用因子.然而目前尚不清楚分泌型淀粉酶在大丽轮枝菌致病过程中发挥的作用.该研究使用BLASTp搜索到大丽轮枝菌淀粉酶VdAmy-1,进而对其功能进行了初步研究.酵母信号肽捕获系统表明VdAmy-1的N端信号肽具有引导蛋白分泌的功能.进一步构建大丽轮枝菌VdAmy-1蛋白编码基因缺失的突变体菌株及其回补菌株,发现突变体菌株对淀粉的利用能力和对棉花的致病性均较野生型明显减弱.以上实验表明VdAmy-1是大丽轮枝菌一个重要的分泌型淀粉酶,在其致病性中起重要作用.     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过ATMT法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个T-DNA插入突变体。利用hiTAIL-PCR技术获得17株T-DNA插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株Vd991相比,出现黄色菌丝型2株,中间菌丝型6株;部分突变体在生长速率(7株)、产孢量(14株)和粗毒素产量(4株)上都发生了具有统计学意义的变化(p0.05);致病力测定表明,9株突变体的致病力较野生型有所降低,在p0.05水平具有统计学意义。【结论】该研究为大丽轮枝菌致病基因的筛选和鉴定提供了理论基础。     

新疆黑白轮枝菌与大丽轮枝菌核糖体基因ITS区的克隆和序列分析

采用真菌核糖体基因内转录间隔区域(ITS)通用引物ITS1和ITS4扩增黑白轮枝菌与大丽轮枝菌核糖体基因的ITS,并对PCR产物进行了克隆和序列比较。实验结果表明,黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的ITS区都由541个碱基组成;供试的2个黑白轮枝菌菌株的ITS碱基序列同源性为100%,供试的2个大丽轮枝菌的ITS碱基序列同源性为99.82%,有1个碱基的差别。黑白轮枝菌和大丽轮枝菌核糖体ITS碱基序列同源性为99.40%,供试的黑白轮枝菌与供试的大丽轮枝菌至少有6个碱基的差别,且差异所在区域较集中。     

棉花黄萎病菌细胞壁几丁质和壳聚糖构成分析

几丁质和壳聚糖是真菌细胞壁的重要组分,在维持细胞稳定性和寄主互作过程中发挥重要作用。为了分析不同发育阶段大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)细胞壁中几丁质和壳聚糖的构成,本研究以强致病力菌株V592为研究对象,依托CFW染色和壳聚糖抗体标记技术,对不同发育阶段大丽轮枝菌细胞壁中几丁质和壳聚糖的构成进行了显微观测。结果表明:大丽轮枝菌细胞壁中几丁质和壳聚糖的构成是一个动态变化的过程,除了分生孢子萌发点细胞壁以外,其它各个阶段的细胞壁中都有几丁质的存在,而壳聚糖主要存在于的分生孢子萌发点位置和芽管细胞壁上,另外侵染结构细胞壁上也存在壳聚糖。本研究对深入了解大丽轮枝菌细胞壁的发育生物学奠定了一定基础。     

紫外线对番茄青枯菌致病性变化的影响

紫外线的亚致死剂量、致死剂量对青枯雷尔氏菌作用的实验表明:亚致死剂量照射不同时间对青枯雷尔氏菌强致病力菌株有不同程度地促进作用,而无杀灭作用及任何抑制和致弱现象;致死剂量照射对强致病力菌株和无致病力菌株影响不同,结果差异极显著,无致病力菌株对紫外线的耐受力要高于强致病力菌株.致死剂量紫外线对强致病力菌株处理2min,抑制率即达100%,致弱率为0;无致病力菌株照射2min与4min的处理,抑制率分别为70.3%和96.3%,处理8min以上,抑制率达100%.     

GDSL脂肪酶增强棉花对大丽轮枝菌的抗性

大丽轮枝菌是影响棉花生长发育的一种通过土传真菌维管束的病菌,严重影响棉花纤维的产量和品质。为研究棉花GDSL脂肪酶(GDSL lipase,GLIP)在植物响应大丽轮枝菌中的重要功能,本研究利用大丽轮枝菌悬浮液对新陆早42号及其转GhGLIP基因的棉花株系叶片进行处理,分析转GhGLIP棉花株系对大丽轮枝菌的生理生化响应。结果表明,棉花GDSL脂肪酶基因GhGLIP能够响应大丽轮枝菌的刺激,转GhGLIP基因棉花株系可显著抑制大丽轮枝菌导致的叶片细胞死亡。与未处理相比,经大丽轮枝菌处理后的野生型和转基因棉花株系植株的GDSL脂肪酶活力显著增加。同时,转基因棉花株系植株过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化物酶的表达显著提升,说明GhGLIP基因诱导了棉花对大丽轮枝菌的抗性。本研究为棉花抵抗大丽轮枝菌的分子机制解析,及进一步利用基因工程技术培育抗病棉花材料提供了有效参考。     

新疆棉田土壤黄萎病菌致病类型和微菌核定量分析

为了明确新疆棉田土壤中黄萎病菌的致病类型及微菌核密度,本研究经重组巢氏PCR建立了双重巢氏PCR,以落叶型黄萎病菌菌株V592和非落叶型黄萎病菌菌株I6的混合DNA为模板,对其检测特异性和灵敏度进行了分析,检测了新疆棉田208份土壤样品的黄萎病菌致病类型。基于实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)建立Ct值与大丽轮枝菌拷贝数及Ct值与微菌核相关性的标准曲线,获得大丽轮枝菌拷贝数和菌核数的关系,定量测定了棉田土壤中黄萎病菌的种群密度。检测结果显示,双重巢氏PCR可同时检测棉花黄萎病菌的落叶型和非落叶型菌系,灵敏度比普通PCR至少提高了104倍。落叶型菌系占供试土样的98. 6%,非落叶型菌系占供试土样的38. 9%,且非落叶型菌系几乎都与落叶型菌系混合发生,表明落叶型菌系是棉田土壤中的优势致病类型。拷贝数(y)与微菌核(x)之间的线性关系为y=11. 54x。不同地块、不同植棉区土壤带菌量均存在差异,阿克苏棉田土壤中微菌核密度最高,塔城的微菌核密度最低。     

超声波对番茄青枯雷尔氏菌致病性变化的影响

用频率为40kHz,功率为250W的超声波处理野生型番茄强致病力青枯雷尔氏菌F.1.3 010703 01,结果表明:在5、10和20min的处理出现3.24%～5.54%的抑制率,而在15和25min的处理出现-1.04%～-2.82%的抑制率;强致病力菌株的弱化指数在0.4461～0.5376之间,强致病力菌株所占的比例在95.83%～96.14%之间;超声波处理不同时间的菌株回接番茄组培苗,回接发病率皆为100%;处理组与对照之间无极显著性差异(P≥0.01).表明处理菌株保持着强致病力菌株的特性.作为一种机械能量形式,超声波对番茄青枯雷尔氏菌F.1.3 010703 01的生长和致病力都没有影响.作为一种物理致弱因子,超声波对青枯雷尔氏菌无致弱作用.     

番茄青枯雷尔氏菌的强致病力与无致病力菌株生长竞争关系的研究

在单独和混合培养条件下,研究了番茄青枯雷尔氏菌的强致病力(RV)与无致病力菌株(RA)的生长能力的差异.单独培养时,24h前无致病力菌株的菌体生长量超过强致病力菌株,24h后强致病力菌株菌体生长量超过无致病力菌株,12h时无致病力菌株的生长速率是强致病力菌株的5.6倍,60h时无致病力菌株的菌量仅为强致病力菌株的0.37倍.混合培养时,混合比例RV RA<1时,两种菌株都呈正增长,但后者比前者增长快,当混合比例RV RA≤1时,强致病力菌呈负增长(-119.57%～-33.57%),无致病力菌呈正增长(84.50%～285.50%).随着RV RA值升高,增长率呈升高的趋势.上述结论表明:无致病菌株在一定的时间内具有高于强致病力菌的生长能力,当与强致病力菌混合时,能较快成为优势种群,这可能是人工大量施用无致病力菌株时,能有效地保护番茄植株在生长初期免受青枯病的危害,在短期内起到一定的防治效果的原因所在.但随着时间的延长,强致病力菌株又重新成为优势种群,这可能是导致无致病力菌防效下降的原因之一.     

蜡状芽孢杆菌对番茄青枯雷尔氏菌致病性的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）从其致病性上可分为能使植株发病的强致病力菌株和不能使植株发病的弱致病力菌株．利用蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）与致病性稳定的青枯雷尔氏菌强致病力菌株进行共培养，处理后的青枯雷尔氏菌在TTC平板上表现为弱毒株的菌落特征，出现了致弱现象．经过16S rDNA基因序列测定，证明了用蜡状芽孢杆菌处理前后的菌株为青枯雷尔氏菌，并非是其它的污染菌株，通过回接番茄盆栽苗发现致弱前的青枯雷尔氏菌能有效引起番茄发生青枯病，而致弱后的菌株丧失致病力．不能引起番茄发病，     

棉花黄萎病菌 T-DNA 插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过 ATMT 法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae ) 650 个 T-DNA 插入突变体。利用 hiTAIL-PCR 技术获得 17 株 T-DNA 插入体侧翼基因序列,通过blast 比对分析表明,其中 16 个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株 Vd991 相比,出现黄色菌丝型 2 株,中间菌丝型 6 株;部分突变体在生长速率( 7 株)、产孢量( 14 株)和粗毒素产量( 4 株)上都发生了具有统计学意义的变化(p <0.05 );致病力测定表明, 9 株突变体的致病力较野生型有所降低,在 p <0.05 水平具有统计学意义。
     

云南省玉米小斑病菌生理小种的初步鉴定

从云南省13个地区42个县(市)采集玉米小斑病样本,分离出113个单孢菌株,并在中国鉴别品种上开展了生理小种鉴定.结果表明,玉米小斑病菌生理小种O,C,S和T小种在云南省均有分布,O小种是优势小种,且O小种菌株具有不同致病力,中等致病力菌株和弱致病力菌株频率明显高于强致病力菌株.此外,生理小种类型在不同海拔上分布存在差异,S小种多分布于高海拔地区.     

长江流域棉花黄萎病菌的致病力多样性和遗传多样性分析

棉花黄萎病是棉花上的重要病害,严重威胁着棉花的产量.从长江流域4个省即湖北省、湖南省、江西省和安徽省采集300多个菌株,选择各省不同县市的67个菌株,对这67个供试菌株进行培养性状的鉴定、致病力的测定以及遗传多样性的分析,结果表明,在67个供试菌株中,就致病力类型而言,强致病力类型、中等致病力类型和弱致病力类型分别占35.82%、43.28%和17.91%.就培养性状类型而言,菌核型、中间型和菌丝型分别占38.81%、22.39%和38.81%.菌株的致病力和菌落培养类型均与地理位置没有相关性,但菌株的致病力与培养性状类型之间存在一定的相关性,强致病菌株大多数为菌核型,而弱致病菌株则以菌丝型为主.利用筛选出的15对RAPD引物对供试菌株DNA扩增并进行遗传多样性的分析结果表明,遗传多样性与菌株来源地无显著相关性,同时,菌株的遗传多样性与菌株致病力和培养性状也没有显著相关性.