人ε-珠蛋白基因5'旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ）,它能专一地与正调控元件ε－ＰＨＥⅡ　ＤＮＡ（－４４６～－４１９ｂｐ）相结合,Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,ε－ＮＭＰｋ是由 ２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成．还发现在 Ｋ５６２,ＨＥＬ和 Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白,它们能与ε－珠蛋白基因 ５’旁侧 ＤＮＡ序列内的沉默子 ＤＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｅｒ,－３９２～－１７７ｂｐ）相结合,它们的结合区带（ｂａｎｄ Ｋ与ｂａｎｄＨ／Ｒ）位置并不完全相同,推测在ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞内可能共同存在着一个与沉默子ＤＮＡ专一结合的核基质蛋白．实验结果表明,核基质蛋白可能积极参与了人ε－珠蛋白基因时空表达的调控．     

发育时期专一性相关的调控因子与人体ε-珠蛋白基因5′旁侧调控元件DNA的结合

人体ε-珠蛋白基因是人体β-类珠蛋白基因簇中胚胎型结构基因,在胚胎发育过程中,它最先在卵黄囊血岛中表达,也最先关闭,呈现出严格红系组织特异性和发育时期专一性特点.最近有人报道,人ε-珠蛋白基因5’旁侧DNA序列对人ε-珠蛋白基因时空表达和调控起着很重要的作用.已鉴定出位于该基因5’旁侧DNA序列内,从-535bp到-453bp为一个正调控元件(PRE),从-392bp到-177bp为一个沉默子(Silenecer)(图1).但目前尚不清楚它们作用的分子机制.     

人ε-珠蛋白基因5''旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ）,它能专一与正调控元件ε－ＰＲＥ－ⅡＤＮＡ（－４４￣４１９ｂｐ）相结合,Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,－ε－ＮＭＰｋ是由２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成,还发现在Ｋ５６２,ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白,它们能ε－珠蛋白基因５′旁侧ＤＮＡ序列     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG (high mobility group)蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白, 它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用. 应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术, 分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子(ε-promoter,-177 ～ + 1 bp) DNA的结合模式. 实验结果表明, HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合, 而HMG14/17不能与它结合. 将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后, HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子 DNA结合, 而HMG14/17却能与之结合. 结果提示, 当 ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时, 它所结合的HMG蛋白是不同的, 推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体 ε-珠蛋白基因的表达调控.     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG（hihg mobility group）蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白，它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用，应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术，分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子（ε-promoter,-177～ 1bp）DNA的结合模式，实验结果表明，HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合，而HMG14/17不能与它结合，将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后，HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子DNA结合，而HMG14/17却能与之结合，结果提示，当ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时，它所结合的HMG蛋白是不同的，推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体ε-珠蛋白基因的表达调控。     

红细胞分化相关基因EDRF2抑制K562细胞中α-珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子, 它在分化后的K562细胞中被诱导表达. Northern blot结果显示, EDRF2全长mRNA约500 bp. 利用RACE技术, 成功扩增了EDRF2mRNA完整的5′-和3′-末端. EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达. Northern blot分析表明, EDRF2能抑制α-珠蛋白基因的表达, 而对γ -珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用. 凝胶阻滞电泳的结果显示, EDRF2对GATA-1, NF-E2和AP1(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用. GATA-1的负调控因子PU.1表达被EDRF2上调, 提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子, 与PU.1协同作用, 下调α-珠蛋白基因在K562细胞中的表达.     

红细胞分化相关基因EDRF6抑制K562细胞中α—珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子,它在分化后的K562细胞中被诱导表达。Northern blot结果显示。EDRF2全长mRNA约500bp。利用RACE技术,成功扩增了EDRF2 mRNA完整的5‘－和3‘－末端。EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达。Northern blot分析表明,EDRF2能抑制α－珠蛋白基因的表达,而对γ－珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用。凝胶阻滞电泳的结果显示,EDRF2对GATA－1,NF－E2和APl(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用。GATA－1的负调控因子PU。1表达被EDRF2上调,提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子,与PU．1协同作用,下调α－珠蛋白基因在K562细胞中的表达。     

与人β-珠蛋白基因5＇旁侧序列内负调控元件(NCR2)相结合的调控因子

人体β类-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达时空秩序性的一个理想模型,在胚胎发育过程中,它的几个结构基因(ε,~Cγ,~Aγ,δ和β-珠蛋白基因)分别在不同的时期和部位开启和关闭。基因的激活与关闭在细胞分化和胚胎发育过程中都具有十分重要的意义,但有关它们的分子机制目前仍不很清楚。成年型的β-珠蛋白基因在胚胎期不表达,出生后主要在人的骨髓中表达,这一事实说明在胚胎期与胎儿期存在某种调控机制抑制了β-珠蛋白基因的开启。     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

miRNA基因和编码基因启动子区核小体定位分析

研究了把基因启动子区的核小体定位对于分析基因的转录调控具有重要意义.利用核小体定位的预测技术——弯曲度谱,分析了编码基因和miRNA基因启动子周围核小体定位的特征.基因的转录起始位点处,有一个核小体缺失区域,且在下游约200bp处,有较强的核小体定位信号.独立转录的内含子miRNA基因与基因间区miRNA基因,在启动子区具有相似的核小体定位特征,在上游0～-400bp间,有一个较宽的核小体缺失区域,在该区域分布有较多的转录因子结合位点;而依赖编码基因转录的内含子miRNA基因,其启动子与蛋白编码基因启动子具有相似的核小体定位特征,在转录起始位点上游-200～-400bp和-400～-600bp处,各有一个较强的核小体定位.这些结果表明,独立转录的miRNA基因(包括基因间区miRNA和独立转录内含子miRNA)和蛋白编码基因,在启动子区可能具有不同的核小体定位特征.核小体定位不仅参与编码基因的转录调节,也影响miRNA基因的转录.     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体 a 基因的调控

为研究白细胞介素2受体a亚基(IL-2Ra)基因中与负调控元件NRE (-391/-381 bp)呈反向重复的序列NIRS (-153/-143 bp)中, 在该基因表达中的作用, 通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性发现, NIRS与NRE不仅共同阻遏IL-2Ra基因的组成性表达, 还共同参与介导PHA对该基因启动子的诱导活性. EMSA检测显示, 激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白; HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白; 但是, 激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象, 其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带. 紫外交联实验检测发现, 在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83. 结果显示, 不同细胞中, 反式作用因子能通过NRE和/或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL-2Ra 基因启动子活性起关键调控作用.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

<正>人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

蛋白质核酸分子在固体介质中能形成专一结合的复合物

为阐明生命活动的一些基本过程,如DNA复制、重组及基因调控等,归根结蒂,需要对蛋白质核酸的相互作用有详尽的了解。近年来用凝胶电泳定量研究蛋白质核酸的相互作用已有重大突破,所用方法非常灵敏,蛋白质和核酸的浓度只需10~(-12)—10~(-14)mol/L。其基本原理如下:一般先将有关的DNA片段用放射性同位素标记,然后用它与细胞抽提物混合,细胞抽提物中能与DNA专一结合的蛋白质就与DNA形成蛋白质核酸复合物,它在凝胶电泳中     

慢病毒介导的siRNA沉默MRP4基因增强急性髓系白血病对阿霉素的敏感性

化疗是急性髓系白血病的标准治疗手段,然而白血病细胞多药耐药的产生为白血病化疗的主要障碍.在耐阿霉素的K562细胞株(K562/ADR)中,MRP4表达较不耐药的K562细胞株明显增高.本研究试图运用慢病毒介导的siRNA沉默MRP4基因后研究能否增强K562/ADR对阿霉素的敏感性.首先设计并构建了5个针对MRP4基因的慢病毒介导的siRNA(lv-shRNAs-MRP4);随后用荧光显微镜观察lv-shRNA-MRP4感染K562/ADR细胞的感染效率;用real-time PCR及Western blot检测感染lv-shRNA-MRP4后K562/ADR细胞MRP4mRNA及蛋白表达;应用MTS法及流式细胞术检测感染lv-shRNAs-MRP4后K562/ADR细胞增殖活性及凋亡.荧光显微镜观察结果可见,K562/ADR细胞lv-shRNA-MRP4感染效率达到80%以上;相比较其他lv-shRNAs-MRP4,lv-shRNA1-MRP4对MRP4基因沉默效应最强;在K562/ADR细胞中lv-shRNA1-MRP4组mRNA及蛋白表达均较对照组明显受抑;联合lv-shRNA1-MRP4与阿霉素后K5...     

K-RRneo细胞生长与分化特性的检测

细胞分化实质上是基因的选择性表达和特异性蛋白质的合成.珠蛋白基因开启、血红蛋白表达是红系细胞分化的典型标志.当红系细胞癌变时这一分化特征丧失,机理未明.薛社普等经过大量的研究发现,骨髓瘤细胞与网织红细胞同种或异种间进行杂交后,在出现去恶性分化特征(癌基因表达抑制/关闭)的同时,往往伴有珠蛋白基因产物(血红蛋白)的表达.我们报道了兔网织红细胞与人红白血病细胞K_(562)融合后形成的K-RRneo细胞生长活动较     

纯合子人βE-珠蛋白基因转基因鼠系的建立

血红蛋白E(Hb E)是我国常见的异常血红蛋白病,它是由β-珠蛋白基因第26位编码子的G→A点突变引起.因Hb E与β-地中海贫血症状相似,又称之为地中海贫血样综合征;它也常与β-地中海贫血复合存在,危害严重.利用转基因动物技术研究真核基因表达调控已取得重要进展.已发现β-珠蛋白基因簇和α-珠蛋白基因簇上游区的DNase Ⅰ敏感区能明显提高珠蛋白基因的表达水平.其中β-基因簇的HS-2和α-基因簇的HS-40具有典型的增强子作用.     

β-珠蛋白基因——至少有两个插入DNA

关于β—珠蛋白mRNA的结构,已经了解得相当详细,如已知其5′端有甲基化的封闭结构,3′端有多聚A,还知道翻译部分的核苷酸序列与氨基酸序列相互对应等。与此相反,关于β-珠蛋白基因的结构及存在方式却了解得极少。但自从蒂尔门(Tilghman)等人对鼠β-珠蛋白基因进行无性繁殖以来,这方面的研究取得了迅速的进展。他们首先揭示出β-珠蛋白基因的核苷酸序列与成熟mRNA的核苷酸序列不完全对应,证明基因内至少有两个插入DNA。     

(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3抑制K562细胞周期并诱导细胞凋亡

利用本实验室建立的方法，合成了20种N-磷酰二肽甲酯，通过MTT比色实验筛选，发现（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对K562细胞的增殖抑制作用明显好于其他的N-磷酰二肽甲酯（IC50为22.66μmol/L），通过对其结构类似物的活性研究，发现DIPP-和-OCH3都是使其具有活性的必不可少的基团，细胞核的形态学改变，DNA琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带及流式细胞仪检测到早期的凋亡细胞都证明（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对K562细胞的增殖抑制作用是通过诱导其发生细胞凋亡实现的，利用碘化丙锭对细胞核内染色质进行着色，流式细胞仪测定细胞内DNA分布情况，发现（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3同时具有细胞周期抑制作用，推测（DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3可能通过将细胞阻滞在G2/M期，再启动这一时相的凋亡调控机制而引发细胞凋亡。     

O~6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因表达提高肿瘤细胞的烷化抗性

耐药是恶性肿瘤化疗成功的主要障碍, 单功能烷化剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),以及双功能烷化剂如嘧啶亚硝脲(ACNU)等主要造成细胞DNA鸟嘌呤第六氧原子的烷基化损伤,导致G→A转换或DNA链间交联形成,继而产生细胞杀伤性效应.细胞内O~6-甲基鸟瞟呤DNA甲基转移酶(O~6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT,EC 2.1.1.63)能够高度专一地修复上述鸟嘌呤烷基化损伤,是决定肿瘤细胞对烷化剂耐药性的重要因素. 我们以前的研究表明,MGMT活性低的细胞(Mer~-)对烷化剂高度敏感,而酶活高的细胞(Mer~+)则表现烷化抗性.人MGMT基因的克隆,使人们有时能利用转基因细胞     

四膜虫大核rRNA基因与核骨架的关系

真核生物细胞中95%以上的RNA为rRNA(核糖体RNA),它们全部是rRNA基因(又称rDNA)的转录产物,其它基因转录的RNA只占5%左右.人们对如此重要的rRNA基因与核骨架(Nuclear skeleton,包括核内骨架Nuclear matrix以及核纤层Neclear lamina)的关系的研究虽然早已开始,并发现一些细胞的rRNA基因是与核骨架结合的,然而rRNA基因与核骨架的真正关系至今远未搞清楚.