蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用

 为了建立体外蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂的高通量筛选模型,筛选潜在的SHP2抑制剂,通过应用大肠杆菌系统克隆表达GST-SHP2 融合蛋白,经过GST-Sepharose 亲和层析分离得到纯化的GST-SHP2 蛋白,建立384 孔板的高通量筛选模型,对48000个有明确结构的小分子化合物进行体外筛选,筛选出75个活性化合物对SHP2的抑制作用大于50%,确定3个化合物具有较高的抑制活性。该筛选模型灵敏、稳定,对SHP2抑制剂药物研发打下了基础。     

弹性蛋白酶抑制剂筛选方法的建立及天然产物对其抑制活性观察

发现弹性蛋白酶抑制剂是治疗肺气肿等疾病药物的重要研发方向之一.本研究用弹性蛋白酶建立微量、高效的体外抑制剂筛选模型,利用西维来司钠作为阳性对照,验证了筛选模型的稳定性和灵敏度,并筛选了33种中药单体对弹性蛋白酶的抑制活性,其中部分化合物表现一定的抑制活性.     

Caspase-3抑制剂的筛选体系构建及药物筛选

Caspase-3是细胞凋亡途径中重要的靶蛋白,研究Caspase-3抑制剂或激活剂,对治疗心脑血管疾病、肿瘤等具有积极意义.利用原核表达系统高效表达Caspase-3,并以表达的粗酶构建基于Caspase-3抑制剂的体外高通量筛选模型,随后对实验室保存的960种放线菌次级代谢产物进行筛选,获得9株具备分泌Caspase-3抑制剂活性的菌株,随后进一步复筛,确认了2株具备分泌高活性的Caspase-3抑制剂的菌株pwh890和pwh891,均可抑制80%的Caspase-3活性.最后对pwh890分泌的次级代谢产物进行初步分离纯化,获得31.3mg纯度较高的抑制剂,为后续的抑制剂的结构解析和改造奠定基础.     

以柯萨奇B3病毒3C蛋白酶为靶点的体外药物筛选模型的建立及应用

建立以柯萨奇B组3型病毒3C蛋白酶(CVB3-3C)为靶点的药物筛选模型,并筛选新型抑制剂。使用原核表达模型实现CVB3-3C蛋白酶体外重组表达。经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析纯化获得高纯度CVB3-3C蛋白。应用荧光共振能量转移法检测蛋白酶活性,建立药物筛选模型。对768种化合物进行筛选,获得了2种对CVB3-3C蛋白酶有较强抑制作用的化合物(MDCE-A008和MDCE-A043),IC50值分别为(60.61±6.26)μmol/L、(105.7±14.88)μmol/L。建立的CVB3-3C蛋白酶药物筛选模型为获得有效抑制剂提供了技术保证。     

以重组人DNA拓扑异构酶Ⅰ为靶位从天然产物及其衍生物中筛选抗肿瘤化合物

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopoⅠ)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,首次使用毕赤酵母表达了hTopoⅠ。在微量反应体系中,测定了化合物抑制hTopoⅠ松驰活性的能力,并用MTT实验验证筛选到的hTopoⅠ抑制剂的抗肿瘤活性。从74个结构新颖的天然产物及人工合成的黄酮类衍生物中筛到6个hTopoⅠ抑制剂,有4个化合物抑制肿瘤细胞生长的能力较强。     

以重组人DNA拓扑异构酶I为靶位从天然产物及其衍生物中筛选抗肿瘤化合物

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopoI)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,首次使用毕赤酵母表达了hTopoⅠ.在微量反应体系中,测定了化合物抑制hTopoⅠ松驰活性的能力,并用MTT实验验证筛选到的hTopoⅠ抑制剂的抗肿瘤活性.从74个结构新颖的天然产物及人工合成的黄酮类衍生物中筛到6个hTopoⅠ抑制剂,有4个化合物抑制肿瘤细胞生长的能力较强.     

6-氮杂甾醇类Ⅱ型5-α还原酶抑制剂的三维定量构效关系研究和虚拟筛选

采用Topomer CoMFA对37个6-氮杂甾醇类抑制剂进行三维定量构效关系分析,新建模型的交互验证和拟合相关系数为q2=0.774,r2=0.965,结果表明模型具有良好的可信度和预测能力.将基于配体的Topomer search虚拟筛选、基于受体的分子对接虚拟筛选和基于3D-QSAR模型的分子活性预测等方法运用到新抑制剂的分级筛选,最终获得4个高活性的新抑制剂分子.新抑制剂的Surflex-dock结果显示6-氮杂甾醇类抑制剂与5AR-Ⅱ靶点的作用模式主要是氢键作用.MTT法生物学活性测试结果显示新抑制剂能显著抑制BPH-1细胞增殖,且抑制程度呈浓度依赖性.通过分子对接机理解释和细胞学实验的抑制前列腺增生活性测试,这两种研究方式相互验证,证明此虚拟筛选方法能够为治疗良性前列腺增生的新药设计提供有效候选化合物.     

新型Caspase-3抑制剂1,2–苯并异噻唑–3–酮–1,4–二取代–1,2,3–三唑类衍生物的合成

为探究对Caspase-3有更高抑制活性的非肽类小分子抑制剂,用"点击反应"合成了一系列1,2–苯并异噻唑–3–酮–1,4–二取代–1,2,3–三唑类衍生物.通过体外Caspase-3和Caspase-7抑制活性测试发现,化合物7c对Caspase-3有最好的抑制活性,IC50达到11.0±1.2,nmol/L.为了更好的理解这些化合物与Caspase-3蛋白的相互作用模式,进行了分子对接实验.结果表明,化合物7c与蛋白作用位点具有很好的结合模式,验证了该化合物具有很好的体外Caspase-3抑制活性.     

新药研发实例——新型4-噻唑烷酮类抗癌先导化合物

以噻唑烷酮化合物为例,介绍了先导化合物的研发过程。运用组合化学的方法设计并合成了小分子化合物库,用以发现和优化先导化合物。用肺癌细胞、抗药性肺癌细胞和正常细胞进行高通量筛选,发现了选择性杀伤抗药性肺癌细胞的化合物。作用机制研究表明活性化合物抑制微管蛋白,将细胞阻滞在G2/M期且可诱导细胞凋亡和自噬,其抗癌活性不依赖于P-糖蛋白。这类先导化合物具有良好的细胞膜通透性,体内试验表明其可有效抑制肿瘤的生长。对60个人体肿瘤细胞系的筛选中,发现这类先导化合物具有广谱的抗癌活性,将在未来癌症治疗研究中起到重要的作用。     

水杨酸类酪氨酸蛋白磷酸酯酶1B抑制剂的分子对接和三维定量构效关系研究

应用Surflex-dock对21个水杨酸类酪氨酸蛋白磷酸酯酶1B抑制剂进行分子对接分析,结果显示水杨酸结构的头部深入活性口袋内部,其氢键决定其与酶结合的稳定性,尾部结构及氢键决定其抑制活性.据此,利用Topomer CoMFA建模时将头尾结构切开分析,从21个化合物中随机选取17个化合物作为训练集,建立3D-QSAR模型,并用包括4个化合物的测试集验证模型的外部预测能力,结果显示模型具有良好的预测能力,预测活性与实测活性的差值均小于0.12μmol/L,该模型可以用于辅助设计同类型新化合物并进行其活性预测.     

家蝇GABA受体抑制剂的药效团模型构建

选取具有较高体外抑制活性且结构差异较大的四类GABA受体抑制剂作为化合物集,利用Catalyst软件,经分子结构搭建、构象分析、药效团识别,构建出了家蝇GABA受体抑制剂的药效团模型.经分析、筛选得到含有一个芳环中心、一个脂肪性疏水中心和两个氢键受体的具有较好预测能力(RMS=0.766449,Correl=0.905422,Weight=1.87642,Config=13.7434)的药效团模型.该模型的构建对揭示配体与GABA受体作用的药效模式及设计新型GABA受体抑制剂具有重要指导意义.     

龙血竭抗癌成分的虚拟筛选及体外抗癌活性检测验证

应用计算机辅助虚拟筛选技术研究龙血竭抗癌活性成分. 以HER2为靶蛋白受体，对龙血竭149种已知化合物进行了虚拟筛选，对其中具有潜在活性的成分进行了体外HER2影响测定以及SK-Br-3抗癌活性检测验证. 结果表明， HER2靶蛋白分子对接模型具有较强的活性分子富集能力，与HER2受体有效对接、具有抗癌潜力的活性分子主要为二氢查耳酮、黄烷、甾体以及芪类成分，与HER2胞外域和胞内域结合的4种成分及能与HER2胞内域结合的3种成分均能显著的抑制体外HER2活性，其中反式3-甲氧基-4′,5-二羟基二苯乙烯、反式3,4′,5-三羟基二苯乙烯能够抑制SK-Br-3癌细胞增殖、改变细胞周期，引发SK-Br-3极显著凋亡，具有良好的体外抗癌活性，可为龙血竭抗癌药物的研发提供基础数据.      

新型磺酰类醛糖还原酶抑制剂的合成及活性研究

以2,4-二甲苯胺为原料,设计并合成了一系列环外磺酰胺(酯)类衍生物,对目标化合物的醛糖还原酶(ALR2)抑制活性进行了测定,并利用分子对接方法研究了抑制剂与醛糖还原酶蛋白的结合模式. 结果显示环外磺酰类化合物8a-d, 12a-b, 16a-b具有良好的体外醛糖还原酶抑制活性,分子模拟预测其能与酶蛋白的活性位点空腔较好结合. 化合物8a-d是一类新型醛糖还原酶抑制剂,活性良好,并可作为先导化合物探索活性更高的醛糖还原酶抑制剂.      

PD-L1表达抑制剂的筛选及其抗肿瘤活性

为了筛选PD-L1启动子活性抑制剂,研究其抑制肿瘤细胞中PD-L1蛋白表达对机体抗肿瘤免疫活性的调节作用.利用荧光素报告基因检测系统对小分子化合物库中的311种化合物进行筛选,发现硫酸长春新碱(vincristine sulfate,VCR)以浓度依赖性抑制PD-L1基因启动子活性.RT-PCR、免疫印迹实验(Westernblot)等生物学评价实验显示:VCR抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞中PD-L1表达以及B16细胞PD-L1蛋白表达和成瘤;VCR增强Jurkat细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性,并促进C57BL/6小鼠细胞因子IL-2和γ-IFN的分泌,增强抗肿瘤活性.研究结果表明,VCR通过抑制PD-L1启动子活性下调肿瘤细胞中PD-L1蛋白表达,从而解除PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制,增强机体对肿瘤细胞的免疫应答和杀伤作用.     

藻蓝色素蛋白通过调控miR-642a-5p抑制LTEP-a2细胞的增殖和迁移

研究藻蓝色素蛋白抑制非小细胞肺癌LTEP-a2体外增殖迁移的机制.以LTEP-a2细胞为模型,采用高通量miRNA转录组学对藻蓝蛋白处理后细胞中差异表达的miRNA进行了筛选;对筛选出的差异miRNA,利用体外转染mimics的方法对细胞的增殖、迁移能力进行验证.研究结果显示,藻蓝蛋白处理LTEP-a2细胞后能够显著增加细胞内miR-642a-5p的表达水平;过表达miR-642a-5p能够显著抑制细胞的体外增殖、迁移能力;此外,藻蓝蛋白可以通过上调miR-642a-5p表达抑制核受体NF-κB信号通路,降低蛋白磷酸化水平,进而抑制LTEP-a2细胞的增殖迁移能力.研究能够为藻蓝色素蛋白的应用以及非小细胞肺癌的治疗提供一定的理论基础.      

PDE4/PDE7双重抑制剂的虚拟筛选研究

为了从现有的药物数据库中寻找具有较好抑制活性的新型PDE4/PDE7双重抑制剂结构,联合应用OpenEye及AutoDock程序对自建的小分子数据库进行虚拟筛选,并对筛选出来的分子进行PDE4/PDE7抑制活性测试.结果得到27个有PDE4/PDE7双重抑制活性的化合物分子,其中有些化合物的抑制率能达到100%.其中有两类化合物的活性高且结构新颖,其母体结构可作为先导结构,用于研发新型的PDE4/PDE7双重抑制剂.     

一种新的MDM2-p53信号通路抑制剂的发现研究

本研究以研发新型小分子MDM2抑制剂为目的,建立了以分子对接为基础的虚拟筛选流程.利用虚拟筛选流程对SPECS化合物库的分子进行类药性筛选、分子对接粗筛、二次筛选以及排序挑选,并通过细胞实验验证这些分子激活p53并抑制肿瘤细胞生长的活性.结果表明M12能够激活p53及其下游信号通路,抑制肿瘤细胞周期并促进肿瘤细胞凋亡.M12与已知MDM2-p53抑制剂结构完全不同,是一种潜在的癌症治疗候选药物.     

一种新的MDM2-p53信号通路抑制剂的研究

本研究以研发新型小分子MDM2抑制剂为目的,建立了以分子对接为基础的虚拟筛选流程.利用虚拟筛选流程对SPECS化合物库的分子进行类药性筛选、分子对接粗筛、二次筛选以及排序挑选,并通过细胞实验验证这些分子激活p53并抑制肿瘤细胞生长的活性.结果表明M12能够激活p53及其下游信号通路,抑制肿瘤细胞周期并促进肿瘤细胞凋亡.M12与已知MDM2-p53抑制剂结构完全不同,是一种潜在的癌症治疗候选药物.     

吡唑类转化生长因子-β受体激酶抑制剂的定量构效关系研究

用分子力学、分子模拟退火动力学、量子化学等方法对转化生长因子-β受体激酶（TβR-Ⅰ）的取代吡唑类抑制剂进行了结构优化．用遗传算法（GFA）并结合多元线性回归方法（MLR）,对该类抑制剂进行了定量构效关系研究,筛选出了影响抑制剂活性的主要因素,建立了定量构效关系方程（QSAR）.结果表明,分子的总偶极矩的Y分量的平方（μy）^2、分子中喹啉环上的氮原子的净电荷QN3、Jurs的相对负电荷表面积RNCS描述等是影响该类化合物抑制活性的主要因素．所得模型对该类化合物关于Tim-Ⅰ的抑制活性有较好的预测效果（R^2=0．834,Rcv^2=0．575,s=0．243,F=13．439）．     

皂角刺中黄酮类化学成分的分离鉴定

目的研究中药材皂角刺中黄酮类化合物化学成分。方法用溶剂萃取、反复柱层析方法，分离纯化皂角刺中黄酮类化合物，通过NMR，MS等波谱技术确定其化学结构，并进行细胞模型的体外活性筛选。结果从皂角刺中分离得到两种黄酮类化合物，结构鉴定为（＋）trans-2R，3R-3’，4’，5，7-tetrahydroxyflavanonol（1）和8-C—glucopyranosyl-3，4’，7-trihydroxyflavone（2）。化合物2显示出明显的组织蛋白酶B抑制活性（CAT-B模型）。结论该两种化合物均为首次从皂角刺中分离得到的单体黄酮类化合物，且发现化合物2具有组织蛋白酶B抑制活性。