结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。     

结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响

为研究结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响。分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株（H37Rv）、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16．3基因缺失突变株（△H37Rv）、卡介苗（BCG）和卡介苗Hsp16．3基因缺失突变株（△BCG）感染RAW264．7巨噬细胞株,使用流式细胞技术于感染1、3、6及12h检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其变化。结果显示,巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中在感染1、3、12h,BCG组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈O．05）;在感染1、3h,△BCG组与AH37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）;在感染3、6、12h,△H37Rv组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,△BCG组与BCG组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。由此可知,结核分枝杆菌Hspl6．3可抑制感染巨噬细胞的凋亡。     

结核分枝杆菌Rv1009基因的克隆、表达及亲和层析纯化

克隆表达结核分枝杆菌Rv1009基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化。采用聚合酶链反应（PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增了Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入到pGEM—Teasv中,序列测定正确后．再亚克隆到融合表达载体pPro—EX HT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv1009蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009蛋白基因．得到融合6个组氨酸残基的Rv1009蛋白纯度大于80％。证实构建了结核分枝杆菌Rv1009基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白．为以后的深入研究奠定了基础．     

双向电泳和肽质谱技术分析结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞引致的差异表达蛋白

利用双向电泳及质谱技术对感染结核杆菌H37Ra株前后的巨噬细胞U937株的蛋白质组进行分离和比较分析．双向电泳后在分子质量20～200ku，等电点pI3～10范围内分离出1913个不同蛋白质斑点，肉眼可以明显看见4个蛋白质斑点在表达上的差异．对其中分子质量约75ku等电点约9．5的蛋白质斑点酶解后，进行质谱分析，鉴定为分子质量75．4ku、等电点9．52的蛋白DEAD／H Box Polypeptide 18．说明用蛋白质组学研究结核杆菌与巨噬细胞相互作用机理是可行的，所鉴定的蛋白质DEAD／H Box Polypeptide 18可能与巨噬细胞防御系统有关．     

乙胺丁醇耐药结核分枝杆菌embB基因分析

了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇(EMB)分离株embB基因突变情况,研究其应用价值。通过聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)技术分析98株新疆部分地区结核分枝杆菌临床分离株embB基因。以H37Rv标准株为对照,52株药物敏感株的embB基因SSCP均泳动正常,RFLP和测序分析与对照株相同。46株耐EMB分离株中,28株(60.9%)embB基因SSCP泳动异常;5株RFLP分析异常;测序分析5株均为306位密码子突变,为ATG→ATA。部分结核分枝杆菌耐EMB是由于其embB基因突变所致,PCR-SSCP和PCR-RFLP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌EMB耐药简便、快速的方法。     

徐州地区结核分枝杆菌耐多药、广泛耐药情况调查

目的:分析徐州地区结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对一、二线抗结核药物耐药情况,了解本地耐多药结核(MDR-TB)、广泛耐药结核病(XDR-TB)所占比例。方法:对627例涂阳肺结核患者的痰标本采用改良罗氏培养法进行结核分枝杆菌培养,同时对培养出的MTB分别进行异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)、丁胺卡那霉素(Amk)、左氧氟沙星(Lfx)药物敏感性试验。结果:比例法检测627株MTB分离株中,单耐63例,多耐28例,耐多药125例,广泛耐药18例。结论:徐州地区耐药情况严重,尤其耐多药、广泛耐药结核病比例较高,为本地区结核病控制增加难度。     

结核分枝杆菌标准株mazEF6缺失株的构建

为构建结核分枝杆菌标准株H37Rv毒素-抗毒素系统maz EF6基因缺失突变株。采用聚合酶链反应(PCR)技术,分别从H37Rv和PUC-19K质粒上扩增出maz EF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;应用融合PCR技术将maz EF6基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,并将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF6-kan,将构建的自杀质粒转化至大肠杆菌DH5a中;利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中;并将该菌株涂于卡那霉素抗性改良罗氏培养基,培养3-4周后,刮取能在卡那霉素抗性培养基中生长的结核分枝杆菌单个菌落,以提取的阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段,并测序。对所获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变,成功获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株。由此可知,本研究为今后研究毒素-抗毒素系统maz EF6基因的生物学功能奠定基础。     

运用反向斑点杂交技术检测四川地区结核分枝杆菌katG基因315位点的突变

为了检测四川地区结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变特点,并建立耐异烟肼结核分枝杆菌快速检测方法。运用反向杂交技术检测四川地区65株耐异烟肼和10株异烟肼敏感结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变,并用DNA直接测序法验证杂交结果。结果显示在65株耐异烟肼结核分枝杆菌中,发现41株在KatG基因315位点发生突变,突变率最大的是AGC→ACC,占90％,其次是AGC→AAC和AGC→ATC突变。DNA序列测定结果进一步验证了反向杂交的结果。运用反向杂交技术检测四川地区结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变的检出率和特异性分别是63％和100％。反向斑点杂交技术能快速有效地检测四川地区结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变。     

前脑啡肽原和热休克蛋白参与宿主对结核分枝杆菌感染的应答

利用双向电泳比较了由临床分离的结核分枝杆菌感染离体巨噬细胞U937前后的全细胞蛋白组表达差异，肽指纹鉴定和生物信息学分析2个表达明显上调的斑点．确定它们分别为热休克蛋白HSP105β和前脑啡肽原．比较蛋白质组学和转录组学研究发现，热休克蛋白表达提高可能源于转录增加．提出了从神经免疫学角度研究结核分枝杆菌致病和宿主免疫机理的新思路，为解释吸毒人群中结核病高发病率提供了基础。     

不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞TfR与Lf的表达

为探讨结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株(BCG)分别感染巨噬细胞,检测细胞内转铁蛋白受体和乳铁蛋白表达量并分析其时相性变化及意义。分别采用结核分枝杆菌H37Rv株和BCG菌株感染巨噬细胞RAW264.7细胞株,于感染后1、6、12、18、24h,应用ELISA技术检测巨噬细胞上清液中TfR和Lf的表达量;应用Western blot技术于上述时间点检测巨噬细胞内TfR的表达量。结果显示,ELISA和Western blot技术均证实感染模型组检测的TfR表达量均高于正常对照组,ELISA结果显示上清液中TfR表达量在感染12和18h差异最明显,具有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示:于模型建成后1、6、18h、差异有统计学意义(P<0.05)。另外,ELISA证明感染可诱导巨噬细胞分泌较高水平的Lf,于感染后6、12、18、24h均高于正常对照组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。由此可知,结核分枝杆菌感染导致巨噬细胞内的TfR和Lf表达更高。     

电阻应变计应变传递研究及误差分析

电阻应变计通过应变过渡区传递应变到敏感栅丝,而此过渡区的范围大小与所测结构的应变有关,使得电阻应变计的灵敏系数发生变化,而非通常测量中使用的常数灵敏系数。本文讨论了灵敏系数变化对测量结果造成的误差,并给出了降低此影响的方法。     

碳纤维高应变率拉伸破坏形态的应变率效应性质

利用反射式间接拉伸Hopkinson杆实验装置，测试碳纤维在应变率1500-3000s^-1范围内的拉伸性质。实验结果表明，碳纤维在拉伸性质上是应变率不敏感材料，这与目前已有实验资料一致，但对碳纤维断裂端的断口形状观测表明，碳纤维破坏形态是与应变率相关的，随着应变率的增加，断口形态逐渐光滑。破坏形态的差异也导致了拉伸力学性质在不同应变率下的微弱差异。     

基于梁的应变运动方程的应变反馈控制

根据柔性体结构控制的特点,提出了结构振动控制的应变反馈方法。首先给出了与内力等价的、以应变表示结构的运动方程。在此基础上讨论了采用结构的应变信号反馈及控制结构振动的可行性。结果表明,结构的振动和应力可以同时得以控制,并且具有相同的衰减速率。最后,指出了存在的问题。     

应变能恒等法在叶片疲劳寿命分析中的应用

根据应变能原理,推导出一种在应变疲劳分析中计算局部应力和应变历程的应变能恒等法.采用这种方法计算出带孔薄板应力集中处在恒幅载荷作用下的应力和应变历程,并与弹塑性有限元和有限元局部应力应变法计算结果对比.分析结果表明:当应力小于材料的抗拉强度895 MPa时,采用应变能恒等法计算的应变历程相对误差最大为8.6%,平均应力...     

钢材应变硬化与应变率效应的试验

利用INSTRON拉伸试验机和Zwick/Roell HTM5020型高速拉伸试验机对Q420钢材开展了不同应变率下（0.001-288s-1）的单轴拉伸试验,研究应变率效应对钢材力学性能的影响。试验结果表明,Q420钢为应变率敏感型材料,其硬化特征随应变率的提高而变化。采用ANSYS中LS-DYNA模块对静力和动力拉伸试验进行仿真模拟,通过逆向反推的方式获得了Q420钢颈缩后的真实应力应变曲线。仿真结果显示,Q420钢材的真实应力应变关系随着应变率的提高,从幂次型的Ludwik准则向指数型的Voce准则转化。为得到更优的动本构模型,在H/V-R本构模型中引入新的应变率准则,以Cowper-Symonds模型中的钢材动力放大系数代替H/V-R本构模型中的线性Wagoner应变率准则。结果显示,修正H/V-R本构模型很好地吻合了试验数据,准确反映了大应变状态下的应变硬化特征和应变率对应变硬化的影响。     

Q420钢材应变硬化与应变率效应的试验

利用INSTRON拉伸试验机和Zwick/Roell HTM5020型高速拉伸试验机对Q420钢材开展了不同应变率下(0.001~288s-1)的单轴拉伸试验,研究应变率效应对钢材力学性能的影响.试验结果表明,Q420钢为应变率敏感型材料,其硬化特征随应变率的提高而变化.采用ANSYS中LSDYNA模块对静力和动力拉伸试验进行仿真模拟,通过逆向反推的方式获得了Q420钢颈缩后的真实应力应变曲线.仿真结果显示,Q420钢材的真实应力应变关系随着应变率的提高,从幂次型的Ludwik准则向指数型的Voce准则转化.为得到更优的动本构模型,在H/V-R本构模型中引入新的应变率准则,以Cowper-Symonds模型中的钢材动力放大系数代替H/V-R本构模型中的线性Wagoner应变率准则.结果显示,修正H/V-R本构模型很好地吻合了试验数据,准确反映了大应变状态下的应变硬化特征和应变率对应变硬化的影响.     

嗜热蛋白酶生产菌的筛选

从温泉水、高温堆肥等样品中初筛到62株嗜热蛋白酶生产菌,进一步复筛出一株高产嗜热蛋白酶的生产菌株DPE7(菌株来自温泉水),该菌株被初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp．)．嗜热蛋白酶生产的最适碳源是葡萄糖, 最佳氮源为酵母粉加硫酸铵,Ca2 对菌株产酶具有促进作用．在65℃、175 r／min、pH 9的产酶培养基中振荡培养 24 h后,发酵液中的酶产量高达23．4 U／mL(60℃测定)．     

降解苯酚类污染物细菌的分离筛选

从某钢铁集团焦化厂污水处理曝气池取样,以苯酚为唯一碳源进行富集培养,然后经过分离与筛选,最后得到4株苯酚降解能力较强的菌株,这些菌株最高可耐受3.0 g.L-1的苯酚.苯酚降解能力测定表明,4株菌在72 h内能将浓度为1.5 g.L-1的苯酚完全降解,72 h内对浓度为2.0 g.L-1苯酚的降解率分别达到99.4%、80.5%、73.5%、70.1%.     

电阻应变片贴装方位偏差对测量结果的影响

认为电阻应变片可以测量构件受的力、力矩、压力等物理量 ,贴装方位不准确是造成应变测量误差的主要原因 ,分析讨论了电阻应变片在一维、二维应力状态下贴装方位偏差所造成的测量误差及其变化规律 :一维情况下 ,相对误差γ不仅与角偏差△α有关 ,而且还与主应变方向的夹角α和所测件泊松比μ有关 .特别的 ,在α =0 ,△α <5°时 ,γ <1 % (μ =0 .2 85 ) ;α≠ 0时 ,随着α的增大 ,△α对所测γ的影响就越大 .二维 ,电阻应变片贴装方位偏差△α造成测量误差γ与两主应变之比ρ及α角有关 ,当ρ一定时 ,α角越大 ,偏差角△α对测量的影响就越显著 .最后 ,设计了实验 ,对一维应力状态下的分析结果进行了验证 .为实际测量工作及传感器设计、制造提供了参考依据     

具有ACC脱氨酶活性及抗枯萎病菌 的 假 单 胞 菌 株 B8

运用新的快速筛选程序,获得了具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1 carboxylate,ACC)脱氨酶活性和拮抗瓜类枯萎病菌双重功能的根际假单胞菌株B