人鼻病毒3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

人鼻病毒3C蛋白酶具有高特异性,且在低温条件下具有较高酶活,目前已被商品化.在大肠杆菌中利用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签可促进人鼻病毒3C蛋白酶的可溶性表达.将人鼻病毒3C蛋白酶的DNA编码序列克隆到pRK792载体上,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,获得MBP-LEVLFQGP-6x His-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白,随后通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白.用该产物切割纯化的MBP-LEVLFQGP-6x His-木聚糖酶融合蛋白,可获得木聚糖酶并用底物平板检测其活性.实验结果表明人鼻病毒3C蛋白酶能够在大肠杆菌中表达,并且能特异性地在其底物识别序列进行切割,从而移除MBP标签,获得仅带有6x His的人鼻病毒3C蛋白酶.该酶可以特异性地去除木聚糖酶融合蛋白中的MBP标签,获得有活性的木聚糖酶.利用MBP标签能够促进人鼻病毒3C蛋白酶可溶性表达,且人鼻病毒3C蛋白酶的活性不受影响,有利于一些不稳定的蛋白在低温下的标签去除和纯化.     

大肠杆菌系列融合表达载体的构建

许多异源蛋白在大肠杆菌内的表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这为蛋白质的功能研究带来困难.融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一.为构建通用型融合表达载体,本研究将5种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(mMBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、翻译起始因子(IF2-I)、氮源利用物质A(NusA)和谷胱甘肽转移酶(GST)以及3种伴侣蛋白(GroEL、DnaK和TF)分别克隆至pET30a(+),构建了系列融合表达载体.这些载体含有相同的克隆位点以及位于融合标签羧基端的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位点.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因hRnBP克隆到mMBP融合表达载体后,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明融合蛋白均得到了高效表达且几乎完全可溶,TEV酶切获得了预期的带型.全细胞偶联生成N-乙酰-D-神经氨酸实验发现mMBP-hRnBP的摩尔转化率较无mMBP标签的体系提高了近60%,证明了融合表达载体中融合标签的适用性.新型的原核融合表达载体为蛋白的融合表达、分离纯化及功能研究提供了更多的选择.     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大...     

重组蛋白Fpr3的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了从分子水平上进一步研究PPIase与PP1的相互作用,将构建好的pGEX-5X-1重组表达质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导后得到了可溶形式表达的融合蛋白.采用GST亲和层析法对重组蛋白进行了纯化,并用Factor Xa对融合蛋白进行柱上酶切,SDSPAGE检测表明可获得较高纯度的GST-Fpr3融合蛋白以及去除GST标签的目的蛋白.用其免疫日本雄性大耳白兔,成功制备了抗GST-Fpr3的多克隆抗体,为Fpr3的空间结构的解析和相应的分子识别过程奠定了基础.     

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.     

人脂联素在大肠杆菌中的可溶性表达

为了提高重组人脂联素在大肠杆菌中的可溶性,构建和表达了增溶标签与人脂联素的融合表达栽体.这些标签包括大肠杆茵硫氧还蛋白和NusA蛋白、酿酒酵母SUMO蛋白和噬热海洋茵Thermotoga maritime 的红素氧还蛋白.结果显示,所有的人脂联素融合蛋白在大肠杆茵中都获得了高水平的表达,但可溶性存在很大差异,说明不同融合标签对人脂联素可溶性表达的促进作用不同.其中,红素氧还蛋白与SUMO蛋白组合一起对人脂联素可溶性的增强作用最为显著,其相应的融合蛋白几乎全部可溶.另外,通过酵母SUMO/Ulp1反应,经His标签亲和层析纯化得到的人脂联素融合蛋白能被有效酶切,加工为人脂联素成熟肽产物.     

基于基因组的TEV蛋白酶的高表达

TEV蛋白酶由于其高酶切活性、酶切位点的专一性和酶切条件的宽容性而在蛋白分离和蛋白质组学研究等领域有着广泛的应用.目前获得TEV蛋白酶的方法是将克隆在质粒上的TEV基因在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中实现过表达.但本方法有一定缺点,如需使用抗生素,这就可能在后续的纯化中引入杂质,菌株群体中不均一性而降低产量等.本研究通过重组工程方法将受T7强启动子驱动的,与麦芽糖结合蛋白MBP融合的TEV蛋白酶基因整合至BL21(DE3)的基因组上进行过表达.MBP-TEV在细胞内自剪切获得分离的TEV.NiNTA亲和层析得到纯化的TEV,产量可达4.2 mg/L.所分离的TEV表达出良好的酶切活性.本菌株有着以之大规模获得TEV的潜力,所建立的通过重组工程将外源基因整合至BL21(DE3)基因组的进行表达的方法也可成为通用的平台技术.     

hIAPP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化和鉴定

基于人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)的氨基酸序列,按照大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性合成基因,并克隆到pMAL-c2x载体中,与MBP蛋白mal E基因融合表达,获得重组表达质粒pMAL-hIAPP.将质粒pMAL-hIAPP转化到表达宿主E. coli BL21(DE3)中,利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白MBP-hIAPP表达.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白MBP-hIAPP的相对分子质量约为4.9×104.利用重组型烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶(rTEV)酶切MBP-hIAPP,并采用凝胶过滤层析的方法分离出高纯度的hIAPP,利用MALDI-TOF质谱进行了验证.     

枯草芽孢杆菌的ade基因在大肠杆菌中的MBP融合表达及活性鉴定

扩增了枯草芽孢杆菌的ade基因, 重组入载体pMal-c2x中, 构建了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的表达体系. 通过IPTG诱导表达, 用MBP亲和层析法, 纯化该融合蛋白（104 700）, 并通过SDS-PAGE对表达及纯化结果进行检验, 对其酶学性质进行了初步研 究. 分析结果表明: 该融合酶蛋白具有显著的腺嘌呤脱氨酶活性, 证明了ade基因是枯草芽孢杆菌中编码腺嘌呤脱氨酶的基因.     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

“真空的真空”的存在性问题

许多科学家包括诺贝尔奖获得者李政道教授都预言,真空是未来物理学的一个重要研究对象.十七世纪的伽利略时代人们曾讨论过"真空"是否存在的问题.当时的学术界分成两派,一派以帕斯卡为代表,认为真空存在,另一派以笛卡尔为代表,认为真空不存在,最后实验证明"真空存在派"正确.现代研究表明,真空并非一无所有,这样就产生了一个新的问题"排除了真空物质后的空间",即"真空的真空"是否存在.本文探讨了与"真真空"有关的问题,提出了一些观测实验方法,这些方法可以帮助我们最终解答"真真空"的存在性问题.     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

人-自观念演进的否定之否定

在人与自然界的关系的演进过程中,形成了与不同文明时期相适应的人-自观念。从＂天人合一＂到＂人定胜天＂再到＂和谐共生＂,这是人-自观念演进的肯定、否定、否定之否定的辩证发展过程,也是一个合乎规律的过程,它们都是时代的产物,都包含着不同程度的合理的因素,我们必须对它们进行具体的辩证的分析。     

行政机关违法设定许可的法律责任探析

对于行政许可违法的法律责任问题，人们往往是从行政许可实施违法的角度进行研究，而对于设定违法及其责任追究的探讨却相对薄弱。然而。行政许可设定一旦违法，其对相对人和社会公共利益的损害将会更大，因此，对许可设定的违法及其责任问题进行研究，以避免违法行政行为的发生，促进政府依法行政，不仅必要而且是非常有意义的。     

曲面"侧"概念的"参照物"理解法

曲面“侧”是一个重要而难以理解的概念,本文对曲面“侧”概念的讲授方法进行了探讨,给出了曲面“侧”概念的“参照物”理解法,通过实践证明,效果良好。     

老年人生活空间移动性影响要素研究进展

 老年人生活空间移动性是老年人在日常生活中能动生活状态的重要表征。在梳理老年人生活空间移动性相关概念、测度方法基础上,分析了物质环境要素和非物质环境要素对老年人生活空间移动性的影响;提炼出有效支持老年人生活空间移动性的中观环境规划、微观环境设计和政策文化扶助层面的策略;指出了老年人生活空间移动性的研究建议和发展方向。     

关于一维非自治时滞系统点态退化一例

给出了一维非自治时滞系统点态退化的一个例子,拓宽了该领域的研究。     

动量守恒定律和动量矩守恒定律的正确表述

现行力学教材和普通物理教材大都把动量守恒定律和动量矩守恒定律视为质点组动量定理和动量矩定理的推论，忽视了守恒星的本质意义，是不正确的．本文绘出正确表述．