Eca109细胞中自噬模型的建立

目的:在食管鳞癌细胞Eca109中建立自噬模型.方法:按照常规细胞培养方法,将pmcherry-GFP-LC3质粒转染进入Eca109细胞,mcherry为红色荧光蛋白,GFP为绿色荧光蛋白,可示踪自噬体形成.加入浓度为50nmol/L自噬激活剂雷帕霉素,建立自噬模型.采用电镜观察雷帕霉素诱导后细胞中自噬小体的产生,激光共聚焦显微镜观察自噬发展的阶段,并对发生自噬行为的细胞进行计数.结果:雷帕霉素诱导后可见明显的自噬小体,激光共聚焦采图可见自噬细胞数量明显增多(P0.05).结论:1.在Eca109细胞中通过加入自噬诱导剂雷帕霉素成功构建细胞自噬模型;2.细胞自噬模型的建立为研究肿瘤细胞自噬活动的现象和分子调控机制提供了新的实验平台.     

活体小鼠脑组织Ca2+敏感荧光染料双光子成像的观察

 使用双光子激光共聚焦显微镜对活体小鼠脑组织（体感皮层）进行形态学和细胞内Ca²⁺变化水平的观察和记录。方法是对小鼠开颅后向脑内注射Ca²⁺敏感荧光染料Oregon Green 488 BAPTA-1乙酰氧基甲酯,然后在双光子显微镜下观察并记录。双光子显微镜下的图像清晰生动,可扫描到大脑皮层以下较深区域,并能检测神经元细胞内Ca²⁺离子即时水平变化。实验结果表明通过注射Ca²⁺敏感荧光染料并结合多光子激光共聚焦显微镜观察活体动物脑部变化的方法可以得到高分辨率图像并且作为分析的来源。     

激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用

介绍了激光扫描共聚焦显微镜的工作原理、常规样品制备要求,以及图像获取的基本方法,包括光路设置及光强度调节、针孔的调节、增益值的调节、透射光路及DIC设置等.在此基础上,进一步介绍了共聚焦在生物学研究领域上的应用技巧,如多通道荧光采集、多层扫描及三维构建、荧光共定位及强度分析、时间序列扫描及光漂白技术,为快速掌握共聚焦的操作技巧提供有力的技术参考.     

甘松新酮对H9C2心肌细胞低氧损伤的作用及其机制

以氯化钴(CoCl₂)构建H9C2心肌细胞低氧损伤模型,研究Nar在其中的作用及机制. CCK-8试剂盒检测细胞活力,流式细胞仪测细胞凋亡,以自噬抑制剂3-MA预作用细胞探讨Nar对自噬的影响,Western Blot检测Beclin-1、LC3II/LC3I、P62、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达,分光光度计测定乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和肌酸激酶(CK)含量. 结果显示:CoCl₂ (500 μmol/L)可抑制约50 %细胞生长,而Nar (50 μmol/L)预处理显著减轻了CoCl₂ (500 μmol/L)诱导的细胞凋亡;另外,Nar通过增加LC3II/LC3I和Beclin-1表达及促进P62降解激活了自噬,但3-MA预作用逆转了该过程;3-MA预作用同时逆转了Nar对CoCl₂造成的H9C2细胞凋亡和氧化损伤的保护作用. 研究表明:Nar在心肌细胞低氧损伤中以诱导自噬抑制凋亡的方式保护心肌细胞,Nar可能成为治疗低氧性心脏病的潜在药物.     

小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其编码蛋白的细胞内定位

研究了小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其在细胞内的定位.提取小鼠8种组织及处于5个发育阶段的胸腺细胞总RNA,逆转录成cDNA后,利用RS21-C6基因特异性引物,观察了RS21-C6基因的表达;同时构建pEGFP-N3/RS21-C6重组表达载体,在激光共聚焦荧光显微镜下观察了细胞内荧光分布.RT-PCR结果表明RS21-C6基因在所检测的组织和细胞中除骨骼肌和CD4SP胸腺亚群外均有不同程度的表达.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,RS21-C6-GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达在胞浆内,RS21-C6-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.     

Ghrelin通过诱导细胞自噬加剧H9c2细胞缺氧复氧损伤

用CoCl₂诱导H9c2细胞缺氧损伤24 h后,再将培养基换成新鲜培养基,以模拟心肌细胞体外缺血-再灌模型,并在此基础上通过ghrelin对细胞自噬的调节来评价ghrelin对心肌细胞缺氧-复氧损伤的调节作用.用流式细胞技术和LDH活性检测细胞凋亡和坏死.WST-1检测细胞活力;DCFH2-DA探针评估细胞内活性氧水平;用Western blotting检测细胞自噬.研究结果表明ghrelin处理的缺氧-复氧损伤细胞活力降低、LDH活性、细胞凋亡、ROS含量及自噬增加,用3MA处理后可明显抑制细胞自噬,并伴随细胞活力的显著升高,因此,ghrelin通过加强细胞自噬加剧了CoCl₂诱导的H9c2细胞缺氧-复氧损伤.     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。     

超高分辨率激光扫描共聚焦显微镜的成像技术与应用

超高分辨率激光扫描共聚焦显微镜在生命科学研究领域中的应用日益广泛。该文以Zeiss LSM 880 Airyscan with STEDYCON超分辨率激光共聚焦显微镜为例,介绍了Airyscan技术和基于受激发射现象的超分辨技术（STED）的原理、应用和参数设置,以期能够为科研工作者究竟采用哪种模式进行图像采集提供参考,以获得最佳的成像效果。     

亚铁螯合酶抑制诱导细胞内原卟啉Ⅸ积聚的肿瘤荧光成像

目的:探讨靶向FECH的siRNA在肿瘤荧光成像中的作用.方法:设计并合成靶向FECH的siRNA,用脂质体转染剂Lipofectamine2000携带后转染H08910PM细胞,用RT-PCR半定量检测细胞中FECHmRNA的表达用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜在体外检测H08910PM细胞的荧光强度.结果:siRNA...     

双光子共聚焦显微镜FV1000 MPE的组成与维护探讨

FV1000 MPE是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的扫描成像系统。广泛应用于生物学、生物医学等科学研究中。双光子共聚焦显微镜的组成及维护等对初学者来说比较复杂,从配置和维护中重要的问题展开讨论,为双光子共聚焦显微镜的使用者和管理者提供参考。