原子力显微镜(AFM)研究转录因子与DNA顺式

用原子力显微镜研究了转录因子ZmDREB1A与顺式作用元件DRE(脱水应答元件)的特异性相互作用. ZmDREB1A与核心序列为ACCGAC的DRE元件和核心序列为AGCCGCC的ERE元件(乙烯应答元件)间相互作用力的比较结果表明, ZmDREB1A能特异地结合DRE元件, 而与ERE元件间无特异性的相互作用. 另外, 通过泊松统计的方法计算出ZmDREB1A转录因子与DRE元件间的单分子相互作用力为99±9 pN. 研究结果表明, 原子力显微镜可作为一种灵敏、可靠的方法来研究转录因子与DNA顺式作用元件间特异性的相互作用力. 与传统的凝胶阻滞实验相比, 原子力显微镜在转录因子的功能分析上具有耗样量低、灵敏度高、无需放射性标记等优势.     

基于AFM的血管生成素与其核酸识体(Aptamer)的相互作用力

基于原子力显微镜(AFM)力测定技术研究了血管生成素与其核酸识体(Aptamer)之间的相互作用力, 并与一系列对照实验中测量的相互作用力进行了比较. 结果表明, 血管生成素与其Aptamer之间存在着特异性相互作用. 另外, 采用Poisson统计的方法计算出血管生成素与其Aptamer间的单分子相互作用力为(133.7±11.7) pN. 这些研究结果的获得有望为更好地揭示血管生成素与Aptamer的识别机理, 进一步解释Aptamer对血管生成素活性的抑制作用提供依据.     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

转铁蛋白及其抗体分子间作用的原子力显微镜探测

采用原子力显微镜对饱和铁转铁蛋白和脱铁转铁蛋白与转铁蛋白抗体之间的相互作用进行研究. 对转铁蛋白抗体层层自组装在喷金基片表面并且与抗原蛋白之间特异性结合的形貌进行了表征. 通过原子力显微镜对分子间力的曲线的探测, 比较了饱和铁转铁蛋白和脱铁转铁蛋白与抗体之间的作用力的差异. 实验表明, 饱和铁转铁蛋白与抗体分子之间结构互相嵌合, 结合更加紧密; 分子间力的曲线亦显示饱和铁转铁蛋白与抗体之间的特异性结合力明显大于脱铁转铁蛋白.     

pBR322质粒DNA的原子力显微镜成象及剪切研究

研究DNA分子间和分子内相互作用力,可以帮助人们了解DNA分子的结构及其功能.由于对这些相互作用力进行直接测量时,不仅需要控制体系的稳定性,同时外加作用力又不能对体系产生影响.因此,目前只是利用X射线,光散射和核磁共振等手段对作用力进行直接的物理或热力学测量.虽然渗透压技术已经应用到DNA双螺旋非特定分子间力的测量,但对于具有特定取向的复杂分子相互作用,就需要在单个分子间进行直接测量.原子力显微镜(AFM)可以检测到10~(-14)N数量级的针尖-样品相互作用力,横向分辨率可达0.01nm,而接触面积只有10nm~2,并且可以在近生理溶液条件下操作,因此它是非常适合研究DNA分子间相互作用力的.事实上,利用AFM研究Biotin-streptavidin体系中的单个分子间相互作用以及DNA双链间的相互作用力已有报道.     

肝氨甲酰磷酸合成酶I基因转录起始位点的测定

氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)是尿素循环的第一个酶,主要存在于肝细胞线粒体中,是肝组织特异酶,与肝细胞的分化有关.我们曾观察到在大鼠肝癌诱发过程中,CPSI酶活性降低,实验证明癌变过程中CPSI基因表达的异常与基因转录调控可能有关.真核基因的转录的调控是通过反式作用因子(trsns-acting factor)与顺式作用元件(cis-acting element)的相互作用而实现的.顺式作用元件多存在于转录起始位点的5′端上游,对基因转录有调控作     

植物转录因子的结构与调控作用

植物各种诱导型基因的表达主要受特定转录因子在转录水平上的调控。典型的转录因子含有ＤＮＡ结合区、转录调控区、寡聚化位点及核定位信号区等功能区域。这些功能域决定转录因子的功能、特性、核定位及调控作用等，转录因子通过这些功能域与启动子顺式作用元件结合或与其他蛋白的相互作用来激活或抑制基因的表达。植物转录因子的结构与功能成为近年来植物分子生物学等研究领域的重要内容。     

拟南芥防卫基因 PDF1.2启动子中GCC盒应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变,结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达,分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件,验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能.通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域.为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域,分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变.在烟草叶片中的瞬时表达分析表明,GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答,而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件.在此基础上,将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子.在烟草叶片中,该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因5′端上游序列特异结合蛋白的鉴定

氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPSⅠ)是肝组织特异酶,与肝细胞分化有关。我们曾观察到,肝癌及癌变过程中CPS_1基因表达降低,并证明可能是由于基因转录调控异常所致。真核基因转录调控是通过顺式作用元件(cisacting element)和反式作用因子(transacting factor)的相互作用而实现的。目前已发现许多与病毒基因、细胞基因启动子、增强子特异结合的蛋白因子,具有转录调控作     

基于AFM 单分子力谱技术的CD20-Rituximab 间相互作用力测量

原子力显微镜(AFM)的发明为测量分子间特异性相互作用力提供了新的技术手段.利用AFM 单分子力谱 (SMFS) 技术分别测量了提纯的CD20, 淋巴瘤Raji 细胞表面的CD20 和淋巴瘤病人B 细胞表面的CD20 与Rituximab (抗CD20 单克隆抗体)之间的相互作用力. 通过探针功能化技术, 将Rituximab 连接到AFM针尖; 通过基底功能化技术, 将提纯的CD20分子吸附到云母表面, 对CD20分子进行了AFM成像, 并测量了CD20与Rituximab 之间的相互作用力; 通过静电吸附和化学固定, 将淋巴瘤Raji 细胞和淋巴瘤病人细胞固定到载玻片表面, 对Raji 细胞和病人细胞进行了AFM 成像, 并分别测量了Raji 细胞表面的CD20 和病人B 细胞表面的CD20 与Rituximab 之间的相互作用力. 比较并分析了在提纯的CD20 分子表面、Raji 细胞表面和病人B 细胞表面测量CD20-Rituximab 相互作用力的差异,实验结果表明Raji 细胞表面的CD20 与Rituximab 之间的相互作用力明显小于提纯的CD20 以及淋巴瘤病人B 细胞表面的CD20 与Rituximab 之间的相互作用力, 为深入研究造成Rituximab 耐药性差异的分子机理提供了技术思路和实验方法.     

牛泡沫病毒内部启动子上顺式作用元件

以牛泡沫病毒(bovine foamy virus, BFV)中国毒株BFV₃₀₂₆为材料, 研究env基因内部启动子(internal promoter, IP)上顺式作用元件的功能特点. 用PCR方法进行系列缺失, 将IP中BFV反式激活因子Tas应答元件(TRE^IP)精确定位于TATA盒近上游的72 bp区段中(9205 ~ 9276). 发现此段可激活同源及异源启动子, 具有典型增强子特性; 此区段与已知SFV-1 TRE^IP近启动子区和SFV-3 TRE^IP序列同源性高, 都具有核因子NF-1(nuclear factor 1)的结合位点, 位置相同, 推测此类顺式作用元件具有相似功能特点.     

水稻WRKY89中的亮氨酸拉链结构增强蛋白与W盒元件的相互作用

WRKY蛋白是一类参与植物生物和非生物胁迫反应、代谢、发育等过程的转录调节因子. 水稻WRKY89与其他的WRKY成员同源性较低, 推测由263个氨基酸组成, 其N端带1个可能的亮氨酸拉链结构. 采用pET-29b载体原核表达了OsWRKY89和其3个N端缺失的衍生物, 并采用Ni柱的方法对表达的蛋白进行了纯化. 凝胶阻滞结果表明, OsWRKY89能与含顺式元件W盒的DNA序列特异结 合, 而缺失N端亮氨酸拉链的OsWRKY89与该元件的结合能力显著下降. 酵母双杂交结果表明, 亮氨酸拉链样结构参与OsWRKY89蛋白的同源相互作用. 进一步缺失OsWRKY89至部分WRKY结构域导致表达的蛋白完全丧失与上述元件的结合活性, 表明WRKY结构域是DNA结合中不可缺少的. 这些结果说明亮氨酸拉链结构在蛋白质与蛋白质互作和DNA与蛋白质中起重要作用.     

拟南芥防卫基因PDF1.2启动子中GCC盒是应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变, 结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达, 分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件, 验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能. 通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域. 为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域, 分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变. 在烟草叶片中的瞬时表达分析表明, GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答, 而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应, 表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件. 在此基础上, 将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子. 在烟草叶片中, 该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

DREB转录因子在提高植物抗逆性中的作用

拟南芥ｒｄ２９Ａ基因编码一种与ＬＥＡ蛋白相似的亲水性很强的蛋白，该基因的表达受干旱、高盐及低温的诱导、ｒｄ２９Ａ基因启动子区域中的有两个与上述环境胁迫应答有关的ＤＲＥ顺式作用元件，利用ｒｄ２９Ａ基因启动子的ＤＲＥ顺式作用元件和酵母Ｏｎｅ－Ｈｙｂｒｉｄ方法，两类与ＤＲＥ元件特异结合，在低温或干旱、调卤胁迫条件下调控报道基因表达的南芥ＤＲＥＢ转录因子被克隆及鉴定，分别定名为ＤＲＥＢ１Ａ￣Ｃ和ＤＲＥＢ２     

拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析

通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.     

牛泡沫病毒内部启动子上顺式作用元件具有增强子特性

以牛泡沫病毒（bovine foamy virus,BFV)中国毒株BFV3026为材料，研究env基因内部启动子（internal promoter,IP)上顺式作用元件的功能特点，用PCT方法进行系列缺失，将IP中BFV反式激活因子Tas 应答元件（TRE^IP）精确定位于TATA盒近上游的72bp区段中（9205－9276）。发现此段可激活同源及异源启动子，具有典型增强子特性；此区段与已知SFV－1 TRE^IP近启动子区和SFV－3TRE^IP近启动子区和SFV－3TRE^IP序列同源性高，都具有核因子NF－1（nuclear factor1）的结合位点, 位置相同，推测此类顺式作用元件具有相似功能特点。     

单分子力谱

基于原子力显微镜技术的单分子力谱是研究高分子体系中的分子内与分子间相互作用, 进而揭示其超分子结构的本质及动态过程的一种新型纳米表征技术. 结合我们近期的研究工作, 概述了单分子力谱的工作原理及单分子拉伸的判断标准, 讨论了单分子力学谱与超分子结构、高分子界面吸附形态与力谱形状、分子间特异性相互作用的直接测量等, 并对该领域的未来发展作了展望.     

果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

铜酞菁与碘代十八烷的可控组装

利用扫描隧道显微镜研究了碘代十八烷与取代酞菁在石墨表面的组装行为. 通过改变连接于酞菁环上的取代基, 可以使之与碘代十八烷在石墨表面形成均匀组装或者相分离结构. 研究结果表明, 酞菁分子间相互作用力的强弱是形成何种组装结构的决定因素.     

转录辅因子CBP/p300提高转录因子C/EBP介导的人白细胞介素5(IL-5)基因启动子活性

IL-5主要由Th2类细胞产生, 在过敏性哮喘等过敏性疾病的发生过程中起着关键的作用. 转录辅因子CBP/p300本身具有组蛋白乙酰转移酶活性, 参与许多基因的转录调控过程. 腺病毒E1A癌蛋白能与CBP/p300蛋白结合并抑制其活性. 我们分析了E1A蛋白在IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因表达调控中的作用, 结果表明E1A蛋白能抑制PMA/离子霉素激活和转录因子C/EBPβ介导的IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的活性. 而突变体E1AΔ2-36蛋白因不能与CBP/p300蛋白结合而不能抑制IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 此结果揭示, 组蛋白乙酰转移酶CBP/p300参与IL-5基因启动子活性的调控. 另外, 转录辅因子CBP/p300和转录因子C/EBPβ可以协同地激活IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 为进一步研究IL-5基因表达调控的机制奠定了基础.