大鼠中性氨基酸转运蛋白HA-SNAT3融合蛋白的构建和鉴定(英文)

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT3是SLC38基因家族N系统的成员之一,主要在脑部和视网膜的星形胶质细胞中表达,负责转运谷氨酰胺,在脑部和肝脏的谷氨酸-谷氨酰胺循环中发挥重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达和定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接的方法将HA标签连接到质粒pBK-CMVΔ(1098-1300)-SNAT3中大鼠SNAT3的N端,构建了真核生物表达载体pBK-CMVΔ-SNAT3.用脂质体转染法将该表达载体瞬时转染进人胚肾细胞(HEK293T cells),通过Western blotting检测HA-SNAT3融合蛋白的表达.结果表明,HA-SNAT3能够正确在细胞膜上表达.pBK-CMVΔ-SNAT3表达载体的成功构建对于进一步研究SNAT3的结构和功能提供了有效方法.     

大鼠中性氨基酸转运蛋白SNAT1-HA融合蛋白的构建和表达(英文)

Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1是一种膜蛋白,属于转运蛋白第38家族(SLC38),在中枢神经系统(CNS)中起到重要的生理学作用.为了更容易地检测SNAT1在细胞膜上的表达,以pBK-CMVΔ-SNAT1为模板,用PCR,双酶切和T4连接酶连接的方法在SNAT1的C端加上了一个HA标签蛋白,构建了一个新质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA.用该质粒瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T),转染36 h以后,融合蛋白SNAT1-HA可以用HA抗体检测.Western blot结果显示在约54 kDa处有一条特异性条带,与预期分子量大小一致.利用重组质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA可以更方便地检测到SNAT1在细胞膜上的表达与定位,为进一步研究SNAT1结构与功能奠定了基础.     

大鼠中性氨基酸转运蛋白SNAT1-HA融合蛋白的构建和表达(英

Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1是一种膜蛋白,属于转运 蛋白第38家族(SLC38),在中枢神经系统(CNS)中起到重要的生理学作 用.为了更容易地检测SNAT1在细胞膜上的表达,以pBK-CMVΔ-SNAT1 为模板,用PCR,双酶切和T4连接酶连接的方法在SNAT1的C端加上了一 个HA标签蛋白,构建了一个新质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA.用该质粒瞬 时转染人胚胎肾细胞(HEK293T),转染36 h以后,融合蛋白SNAT1-HA可 以用HA抗体检测.Western blo     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.     

pBK-CMV⊿-EGFP-SNAT2质粒载体构建及其表达鉴定

SNAT2是SLC38基因家族编码的Na＋偶联中性氨基酸转运蛋白中属于systemA的成员之一．它在谷氨酸一谷氨酰胺循环、肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用．增强型绿色荧光蛋白EGFP的连接对于SNAT2在细胞表达中的定位以及检测都有很大的帮助．采用PCR扩增和酶切技术将EGFP连接到质粒pBK-CMV△-SNAT2中SNAT2的N端．通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和测序验证得到pBK-CMV△-EGFP—SNAT2质粒载体,将构建好的质粒瞬时转染进人胚肾细胞（HEK293cells）用Westernblot和激光共聚焦电子显微镜检测EGFP-SNAT2的表达与亚细胞定位．结果表明：EGFP．SNAT2在细胞中正确表达并定位于细胞膜上．pBK．CMV么．EGFP．SNAT2质粒载体的构建对于进一步研究SNAT2的结构和功能具有重要意义．     

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)多克隆抗体的制备

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)属于SLC38家族,参与小的中性氨基酸跨膜转运,在哺乳动物组织中广泛表达.SNAT2的功能紊乱可以导致许多神经性疾病,如阿尔茨海默症、帕金森症等.采用PCR方法扩增得到SNAT2氨基端75个氨基酸的编码序列,构建重组质粒pET28a-SNAT2-75aa,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达重组蛋白.利用组氨酸标签蛋白经镍柱亲和纯化后得到了纯度在95%以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa,将其作为免疫原免疫新西兰大白兔,从而获得SNAT2多克隆抗体.采用巯丙基琼脂糖凝胶6B(Thiopropyl sepharose)固定抗原亲和纯化法进一步对该抗体进行纯化,纯化后的抗体效价至少提高10倍.蛋白免疫印迹确定该抗体对SNAT2具有高度的特异性,表明SNAT2多克隆抗体制备的成功,为进一步研究SNAT2蛋白的结构和功能奠定了生化基础.     

膜片钳全细胞记录法在研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制中的应用

为了研究中性氨基酸转运蛋白-谷氨酰胺转运蛋白的结构与功能,采用膜片钳全细胞记录法测定谷氨酰胺转运蛋白2介导的电流.结果表明:谷氨酰胺转运蛋白诱导了底物氨基酸和Na+浓度依赖性电流,可用于测定底物氨基酸和Na+对转运蛋白的表观亲和常数Km,SNAT2野生型对丙氨酸的表现亲和常数KmAla为(200±5)×10-6mol/L,对Na+的表观亲和常数KmNa为(100±7)×10-3mol/L.谷氨酸转运蛋白转运底物氨基酸过程是生电的过程,在膜电势负值时氨基酸转运电流增大,可用于转运机制的研究.因此膜片钳全细胞记录法是研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制的有效方法.     

N-糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定

N-糖酰胺酶F(PNGase F)是由革兰氏阴性菌——脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量为34.8 kDa的去糖基化酶.本研究通过PCR技术扩增出945 bp的N-糖酰胺酶F基因,经酶切、连接,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F.将pET28a-PNGase F转入大肠杆菌BL21中,16℃诱导表达及Ni柱纯化后,SDS-PAGE鉴定,获得超过95%纯度的可溶性表达的N-糖酰胺酶F.对Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)和2(SNAT2)进行脱糖基化作用检测,结果证明:纯化的N-糖酰胺酶F对SNAT1和SNAT2具有高效的脱糖基化作用.     

甘草水通道蛋白基因（GuPIP1）RNAi双元表达载体的构建及鉴定

植物水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异蛋白孔道．本文根据植物中hpRNA（hairpinRNA）的原理,以甘草质膜水通道蛋白基因GuPIP1为靶基因,在GuPIP1-cDNA序列中选择378bp作为构建RNAi的序列,经三次亚克隆,最后形成含GuPIP1-hpRNAi表达盒的双元表达载体,并转入农杆菌EHA105．     

表达EGFR与HER2双特异性抗体融合蛋白腺病毒载体的构建及表达

目的：构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力。方法：通过合拉PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2-Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法（IFA）检测所表达的融合蛋白与EGFR( )Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2( )的SK-OV-3细胞膜结合的特异性。结果：ELISA检测分析表明,Ad5-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/ml-317.3 ng/ml;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合。 结论：成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-HERIN,而且AT2-HERIN蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合。     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

胞内型磷脂酶A2基因亚克隆与基因表达

目的 研究花生四稀酸在细胞中的释放及前列腺素的合成,构建与花生四稀酸释放相关的表达系统。即胞内型磷脂酶Ａ２（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｃＰＬＡ２）ｃＤＮＡ－ｐＲＣ／ＣＭＶ。方法 从克隆载体ｐＭＴ２用Ｓａｌ１制备ｃＰＡＬ２ｃＤＮＡ;平末端连接ｃＰＡＬ２－ｐＲＣ／ＣＭＶ;转染鼠巨噬细胞及筛选正向阳性克隆;ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ｃＰＬＡ２ ｃＤＮＡ基因表达。结果 人ｃＰＬＡ     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

Restoration of rat calvarial defects by poly（lactide-co-glycolide）/ hydroxyapatite scaffolds loaded with bone mesenchymal stem cells and DNA complexes

A composite construct comprising of a bone mesenchymal stem cell (BMSC) sheet, plasmid DNA, encoding human bone morphogenic protein-2 (hBMP-2), and poly(lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite (PLGA/HA) sponge was designed and employed in the restoration of rat calvarial defects. To improve gene transfection efficiency, a cationic chitosan derivative, N,N,N,-trimethyl chitosan chloride (TMC), was employed as the vector. The TMC/DNA complexes had a transfection efficiency of 13% in rat BMSCs, resulting in heterogeneous hBMP-2 expression in a 10-d culture period in vitro. In vivo culture of the composite constructs was performed by implantation into rat full-thickness calvarial defects, using constructs lacking pDNA-hBMP-2 or BMSC sheets as controls. Significantly higher heterogeneous expression of hBMP-2 was detected in vivo at 2 weeks for the cell sheet/DNA complex/scaffold constructs, compared with the constructs lacking pDNA-hBMP-2 or BMSC sheets. New bone formation was evident as early as 4 weeks in the experimental constructs. At 8 weeks, partial bridging of calvarial defects was observed in the experimental constructs, which was significantly better than the constructs lacking pDNA-hBMP-2 or BMSC sheets. Therefore, the combination of the PLGA/HA scaffold with BMSC sheets and gene therapy vectors is effective at enhancing bone formation.     

hSOD基因在大白鼠肺上皮细胞中的表达

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ为运载体,构建了受控于ＣＭＶ启动子的ｈＳＯＤ基因的表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ＿ＳＯＤ,用脂质体转染法转染大白鼠肺上皮细胞Ｌ２细胞后,经抗生素Ｇ４１８选择性培养,获得与细胞染色体ＤＮＡ稳定整合的ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞,经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｓ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｓ分析,结果表明,ｈＳＯＤ在细胞中得到稳定表达,同时测定细胞ＳＯＤ酶活性,ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞的ＳＯＤ酶活性是空载体导入细胞和父本细胞的约２倍,并且在选择细胞克隆之后的６０天内是持续的．