PP4低表达对人乳腺癌细胞MCF7增殖的影响

蛋白磷酸酶4 (protein phosphatase 4, PP4)在果蝇、线虫及哺乳动物细胞中都可定位于中心体上, 且在果蝇和线虫中参与了中心体成熟. 为探讨PP4在哺乳动物细胞中的功能, 通过RT-PCR的方法扩增得到PP4基因全长序列, 构建pEGFP-C1-PP4融合蛋白表达质粒. 将该质粒转染MCF7细胞, 用间接免疫荧光技术确认PP4在MCF7细胞中的中心体定位. 将PP4蛋白中非磷酸酶保守区序列作为反义抑制作用的靶序列, 构建真核表达重组质粒pXJ41-as-PP4并转染MCF7细胞, G418筛选获得稳定的PP4表达受抑制的细胞株MCF7pXJ41-as-PP4. 对此细胞株进行细胞形态、骨架结构、生长特性及有丝分裂过程观察分析, 发现其生长速率明显减慢, 血清依赖性增强, TdR双阻断进行周期同步化结合流式细胞术以及有丝分裂指数分析发现细胞进入M期受阻. 间接免疫荧光检测发现, 细胞中微管组织紊乱, 细胞核物质增加, 细胞群体中多核细胞比例增加, 有丝分裂过程发生异常, 出现较多多极分裂现象. 这些结果表明, 在哺乳动物细胞中, PP4的正常表达对中心体正常行使微管组织功能是必要的, 抑制PP4表达将导致细胞增殖及周期进程发生异常.     

Q156A天花粉蛋白的晶体结构研究

核糖体失活蛋白（RIPs）是一类具有RNA N-糖苷酶活性的毒蛋白,它水解真核细胞28SrRNA第4324位腺苷酸的N-糖苷键,释放出一个腺嘌吟碱基,使核糖体失活。天花粉蛋白（TCS）是单链核糖体失活蛋白的重要代表。我们早已报道了天花粉蛋白0.173nm分辨率的晶体结构。关于天花粉蛋白结构与功能关系的深入研究,已经发表了天花粉蛋白与底物类似物的复合物晶体结构。我们还对一些保守残基的突变体进行了研究,其中R22LTCS和Y14F TCS的晶体结构已经测定,Arg22和Tyr14是位于活性口袋外,但与活性口袋又有密切联系的保守残基,其侧链形成的氢键也十分保守。在TCS晶体结构中还有一类保守残基形成的氢（盐）键也是十分保守的,它们是处于活性口袋之内的残基形成的,如Q156的NH_2与E189的OE2,Y111的OH与E160的OE2,R122的NH_2与E189的OE1等。为了探讨活性口袋内这些保守氢键对活性部位构象和活性的影响,我们用基因定位突变方法,把保守残基     

多变鱼腥藻藻胆体内杆-核复合物的分离与表征

与其他大多数蓝藻(Cyancbacteria)一样,多变鱼腥藻内藻胆体的形状也呈半圆盘型.构成藻胆体的藻胆蛋白(Phycobiliproteins)为藻红蓝蛋白(PEC)、C-藻蓝蛋白(C-PC)和变藻蓝蛋白(APC),其能量传递按PEC→C-PC→APC的顺序进行.尽管已利用各种光谱技术对藻胆蛋白、藻胆体和活藻进行了比较详细的研究,而且,C-PC,PEC和APC的高分辨率晶体结构也已确定,但两种蛋白之间的联系仍不清楚,特别是能量如何由杆的末端传递进核成为目前研究中的关键问题,因为关于藻胆体的关键结构部分,即杆-核复合物的结构,即尚未得知,所以,本研究工作对完善藻胆体工作模型具有重大意义.我们利用柱层析技术分离得到杆-核复合物(αβ)_6~(pc)L_(RC)~(27)(αβ)_3~(APC)L_c~(8.9),通过光谱技术、电泳方法对之进行表征,并提出该复合物的结构模型,为进一步研究其功能奠定了物质基础.     

AtGRIP蛋白在拟南芥根冠细胞高尔基体反面网络分泌囊泡的定位

动物与真菌细胞的GRIP蛋白定位于高尔基体反面网络, 并对高尔基体的结构与功能有重要作用. 通过RT-PCR方法从拟南芥植株RNA中扩增得到AtGRIP的cDNA; 利用原核表达和亲和层析的方法, 获得AtGRIP部分片段的GST融合蛋白, 进而得到相应蛋白的多克隆抗体. 利用纯化的AtGRIP抗体进行免疫印迹, 确认拟南芥AtGRIP蛋白的分子量为92 kD, 并发现其在拟南芥根、茎、叶和花中均有表达; 免疫荧光标记AtGRIP和Nag-GFP的共定位说明, AtGRIP蛋白分布于拟南芥细胞高尔基体; 免疫金标结合电子显微镜观察发现, AtGRIP蛋白主要定位于拟南芥根冠细胞高尔基体反面网络的囊泡膜. 以上结果说明, 动植物细胞间GRIP蛋白在高尔基体上的定位是保守的; 同时也说明AtGRIP蛋白可能参与了对植物细胞高尔基体反面网络结构与功能的调控.     

水疱性口炎病毒L蛋白N端存在新的定位信号

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) L蛋白是该病毒复制酶的主要成分, 分子量约为241 kD. 通过构建L蛋白缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的方式, 将融合蛋白置于T7启动子或CMV启动子下游, 在多种动物细胞中瞬时表达了重组的融合蛋白. 荧光显微镜观察结果显示, 仅保留N端96个氨基酸残基或缺失N端120个以上残基时, 融合蛋白均匀分布于整个细胞质中, 而含有N端120个以上残基时, 融合蛋白呈点状或局部分布于核周围部位. 截取L蛋白96～120氨基酸片段, 连接到GFP蛋白氨基端, 同样融合蛋白亦特异性地分布到核周围局部区域. 进一步研究含定位信号的25个残基片段发现, 仅13个残基的肽段QGYSFLHEVDKEA(108 ~ 120)就具有定位功能, 缺失D或V均导致定位信号完全丧失. 含有这13个残基的GFP融合蛋白, 在多种细胞和不同表达模式下均显示了同样的分布规律, 表明L蛋白N端这种定位信号具有独立的定位功能, 并且在不同细胞中是保守的.     

酪氨酸蛋白磷酸酶可能影响ABA的积累和参与植物细胞水分胁迫信号传递

以水分亏缺诱发ABA积累的“刺激-反应”系统为模型对玉米胚芽鞘细胞的逆境信号传递进行了研究. 结果表明, 水分亏缺诱导的ABA积累可被质膜H⁺-ATPase及酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTPase)专一抑制剂NaVO₃阻断. 水分亏缺对质膜H⁺-ATPase活性没有影响, 质膜H⁺- ATPase激活剂也不能诱导ABA积累, 表明ABA积累和质膜H⁺-ATPase没有关系. 进一步研究表明, 水分亏缺诱导的ABA积累可被PTPase专一抑制剂PAO抑制, 并且水分亏缺可大大激活蛋白磷酸酶活性, 表明蛋白磷酸酶参与了细胞逆境信号传递. 脱水玉米胚芽鞘中至少含有4种以上的蛋白磷酸酶组分, 其中仅有1个组分是对NaVO₃敏感的. 对NaVO3敏感的蛋白磷酸酶组分进一步纯化, 最终得到了在SDS-PAGE上惟一的分子量为66 kD的蛋白组分. 该蛋白磷酸酶对PTPase专一底物呈现很高的活性, 最适pH为6.0. 除可被PTPase特征抑制剂NaVO₃抑制外, 还可被其他PTPase特征抑制剂如PAO, Zn²⁺, MO₃3+抑制, 但活性不受Ca²⁺和Mg²⁺的影响, 表明该纯化的蛋白磷酸酶可能为PTPase. 除对PTPase专一抑制剂敏感外, 该纯化的蛋白酶活性还对ABA积累的阻断剂DTT敏感, 这为PTPase参与ABA积累调控的细胞逆境信息传递提供了有力证据.     

从基于结构定义的序列模体识别蛋白质的超家族

以进化上相距较远的蛋白质酪氨酸磷酸酶Ⅰ和Ⅱ为例, 通过结构比较和基于结构的序列比对及共同保守区域残基替换模式的分析, 定义了基于结构的序列模体. 利用这种新的模体对SWISS-PROT和TrEMBL蛋白质序列库进行搜索, 可特异性地同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ, 其识别正确率可达98.4%. 而在此之前, 尚未见可同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ序列模体的报道.     

NPA motif在水通道蛋白AQP1表达和转水功能中的重要性

水通道蛋白(AQP)序列中的两个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸序列(NPA motif)是水通道蛋白家族中高度保守的特征性序列, 其晶体结构研究显示, 两个NPA motifs位于通道中心的狭窄部位, 直接参与水分子的结合和选择性通过. 为了进一步研究两个NPA motifs在水通道蛋白结构、功能和生源学(biogenesis)方面的重要性, 通过点突变方法分别获得单独缺失NPA1或NPA2 motif以及同时缺失两个NPA motifs的3种水通道AQP1基因突变型. 将3种AQP1突变cDNA分别亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1, 建立稳定转染3种AQP1基因突变型的CHO细胞系. AQP1免疫荧光分析显示, 3种AQP1突变蛋白均能正常表达并定位于质膜, 显示AQP1蛋白质表达和细胞内加工过程未受NPA motifs缺失的影响. 分别对表达3种AQP1突变蛋白的CHO细胞进行质膜水通透性功能分析, 并与表达野生型AQP1的CHO细胞进行比较, 结果显示, 缺失NPA1或NPA2引起AQP1转水功能下降49.6%和 46.7%, 而同时缺失两个NPA motifs的AQP1转水功能与野生型AQP1相似. 上述结果显示, 水通道AQP1中的NPA motifs在AQP1转水功能中发挥重要作用, 但对于AQP1蛋白的表达、细胞内加工和通道基本结构的形成并不起关键作用.     

细胞壁连接的类受体激酶(WAK):植物细胞壁与细胞质联系的重要蛋白

细胞壁连接的类受体激酶(WAK)是一类特殊的植物类受体激酶, 与细胞壁中的果胶共价交联. 在结构上, WAK分为胞外域、跨膜域和胞内激酶结构域, 胞外域中存在保守的EGF重复序列. WAK以多基因家族形成存在, 其表达模式具有组织特异性, 主要在叶、茎中表达, 在功能上参与病原菌反应、细胞伸长调控、铝胁迫反应等. WAK1在细胞外与富含甘氨酸的蛋白质AtGRP3特异结合, 在胞内与蛋白磷酸酶KAPP结合并形成约500 kD的AtGRP3-WAK1-KAPP复合体. 植物中还存在与WAK结构相似的类WAK蛋白(WAKL)家族. 本文结合WAK结构特点和作用机制认为WAK/WAKL可能是植物细胞壁与细胞质进行联系和通讯的重要蛋白.     

植物转录因子的结构与调控作用

植物各种诱导型基因的表达主要受特定转录因子在转录水平上的调控。典型的转录因子含有ＤＮＡ结合区、转录调控区、寡聚化位点及核定位信号区等功能区域。这些功能域决定转录因子的功能、特性、核定位及调控作用等，转录因子通过这些功能域与启动子顺式作用元件结合或与其他蛋白的相互作用来激活或抑制基因的表达。植物转录因子的结构与功能成为近年来植物分子生物学等研究领域的重要内容。     

Y14F天花粉蛋白的晶体结构研究

核糖体失活蛋白（Ribosome inactivating protein,RIP）是广泛存在于植物界的蛋白毒素,天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）又是该家族中的一个重要成员。TCS及其同源蛋白的高分辨率晶体结构为进行结构与功能关系的研究打下了良好的基础,通过对同源蛋白的结构比较发现在结构中存在着很保守的氢键。为了探讨这些保守氢键对结构与功能的影响,我们用基因定位突变的方法,对形成保守氢键的残基进行突变,测定这些突变体的活性与晶体结构,可以加深我们对这些保守氢键所起作用的认识。TCS中Tyr14的羟基与Ser157的主链氧之间形成保守氢键,这一氢键在螺旋α5的弯折处,而且Ser157的主链碳基氧明显偏离了正常螺旋中的与螺旋轴平行的方向,这一现象在已知的RIPs结构中都存在。为了考察这一保守氢键对螺旋α5弯折的形成所起的作用,我们将Tyr14突变为Phe,这样突变后将保留芳香环侧链的特性,突变后的构象变化主要来自这一保守氢键的消失,以便于考察这一保守氢键对螺旋     

异源三体G蛋白研究

异原三体G蛋白由α、β和γ三亚单位组成，α含有结合鸟苷酸的G区域和螺旋区域，β为7组重复对称的螺旋浆状βγ形成稳定二体，受体、G蛋白、效应物和辅助蛋白形成信息传导复合体于质膜内侧，经受体激活G蛋白，Gα.GTP和Gβγ分别与效应物互相作用，G蛋白为分子开关，Gα引发信号的持续时间取决于GTP水解速度，终止Gβγ-效应物信号传导依赖Gα.GDP和Gβγ重组成异源三体，G蛋白功能受到鸟苷酸交换因子和GTPase激活物等其他蛋白的调节。     

从基于结构定义的序列模体识别蛋白质的超家族

以进化上相距较远的蛋白质酪氨酸磷酸酶Ⅰ和Ⅱ为例，通过结构比较和基于结构的序列比对及共同保守区域残基替换模式的分析，定义了基于结构的序列模体。利用这种新的模体对SWISS－PROT和TrEMBL蛋白质序列进行搜索，可特异性地同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ，其识别正确率可达98．4％，而在此之前，尚未见可同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ序列模体的报道。     

fibrillarin在有丝分裂过程中分布于纺锤体两极

fibrillarin是核仁的一个主要蛋白成分，细胞分裂时它要经历从核仁到细胞质的重新分布过程，并且与细胞分裂后核仁的重新组装有着密切的关系。为了研究有丝分裂过程中fibrillarin的动态变化及与其他细胞结构的关系，构建了fibrillarin的真核表达载体，采用cDNA转染，免疫荧光标记和免疫共沉淀等方法证明了处于分裂期的HeLa细胞中fibrillarin不但分布于细胞质，而且还有一部分定位于纺锤体两极的中心体部位，并且与与NuMA蛋白共定位，当使用药物将分裂期细胞的微管结构解聚后，fibrillarin在两极聚集的现象消失，而后随着纺锤体的重新组装，fibrillarin又在两极重新出现，体外非细胞体系的实验也证明了fibrillarin和分裂期细胞中微管中心体结构结合在一起。     

条斑紫菜变藻蓝蛋白立方晶系的初步晶体学研究

蓝绿藻和绿藻中含有的藻胆体是光吸收和传递的功能单位,这些超分子聚集体位于线粒体膜的外表面,可吸收波长从450～650nm的可见光,其光能传递效率接近100%.电子光谱的研究表明藻胆体由核心和天线两部分组成,两部分均由藻胆蛋白和连接蛋白构成.核心部分主要为变藻蓝蛋白(allophycocyanin)所占有,其位于光合膜的外表面,靠近光系统Ⅱ,天线部分包括藻蓝蛋白(phycocyanin)和藻红蛋白(phycoerythrin),藻蓝蛋白靠近变藻蓝蛋白,而藻红蛋白处于天线的顶端.光能传递的途径为:光子→藻红蛋白→藻蓝蛋白→变藻蓝蛋白→光合反应中心的叶绿素a.到目前为止已有数种藻胆蛋白的晶体结构得到了测定.由于变藻蓝蛋白位于核心部位,直接将光能传递给光反应中心,其三维结构的研究一直受到人们的重视.1995年Breic等首次报道了取自单细胞蓝藻钝顶螺旋藻spirulina platensis的变藻蓝蛋白0.23nm分辨率的晶体结构.但红藻和蓝绿藻的出现相差16亿年,其间发生     

G蛋白偶联受体的结构研究与药物研发

G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRs)是人体内最大的膜受体蛋白家族,具有保守的7次跨膜螺旋结构.GPCR可识别细胞外的各种信号分子,如激素、神经递质、离子、光、气味分子等,与之结合后发生构象改变,随后与细胞内的效应蛋白(包括G蛋白、GPCR激酶GRK和阻遏蛋白)相互作用,从而诱导各种细胞反应.作为分布最广泛的细胞表面蛋白,GPCR在所有重要的生理活动中发挥不可或缺的功能作用,是心血管疾病、神经系统疾病、炎症、代谢性疾病、癌症等多种疾病的重要药物靶点.美国食品药品监督管理局(FDA)批准的药物中约34%以GPCR为作用靶点,2011~2015年间,GPCR药物的销售份额占据全球上市药物的27%.近年来,GPCR的结构生物学研究取得了长足的发展,研究成果揭示了GPCR对配体识别和信号转导的分子机制,并为基于结构的药物研发提供了重要信息.本文详细介绍GPCR的结构研究与药物研发进展,并就GPCR结构和功能研究的未来发展方向提出建议.     

一种新的中心体常驻蛋白的鉴定

利用膜特异结合抗体洗脱法，用一例自身免疫病人血清鉴定了一种新的中心体蛋白３１／２９抗原。免疫荧光结果显示这种抗原定位于中心体处，不依赖于细胞周期的变化，属于一种中心体常驻蛋白。为了研究细胞核周期与中心体复制之间的协调关系，利用此抗血清以及Ｃｅｎｔｒｉｎ和γ－微管蛋白（γ－ｔｕｂｕｌｉｎ）抗体研究了Ｖ７９－８细胞在人工诱导产生早熟染色体凝集（ＰＣＣ）现象时其中心体复制周期的变化。结果发现在羟基脲抑制     

果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

鉴定HIV-1包膜蛋白gp41的近膜端外部区与其 N端三聚体结构域之间的相互作用: 病毒融合相关的潜在机制

人类Ⅰ型免疫缺陷病毒(human immunodeficiency class I, HIV-1)包膜蛋白gp41的近膜端外部区(membrane proximal external region, MPER)在HIV-1的各个分化株之间相当保守, 这暗示MPER区对于病毒的生存和侵染均具有十分重要的作用. 目前研究表明, 两个靶向HIV-1且具有最广泛中和活性的单抗2F5和4E10, 都特异地识别该区域, 进而有效地抑制包膜蛋白介导的病毒膜融合过程. 我们先前的研究表明, 4E10抗体表位的抗原性和免疫原性会随着gp41融合核心区域的结构调整而发生显著的改变, 提示在gp41蛋白的MPER区与融合核心区之间很有可能存在某种联系, 并与gp41介导的膜融合过程相关. 本研究利用各种不同的gp41融合核心区衍生多肽, 检测了4E10表位多肽(D4E10P)与它们之间的反应性. 其中, 具有gp41蛋白核心区N-trimer结构的多肽(N-trimer-6HB)显示出很强的结合活性. 进一步对N-trimer-6HB多肽进行噬菌体文库筛选, 发现 4E10表位上一个短的模体序列(WF)很有可能对gp41的N-trimer和MPER区之间的相互作用发挥了至关重要的作用, 导致MPER区以潜在的方式参与病毒包膜和靶细胞膜间的融合过程.     

分选链接蛋白家族研究进展

分选链接蛋白(sorting nexins,SNXs)是一类含有吞噬细胞氧化酶同源性结构域(Phoxhomology domain,PX domain)蛋白的统称,在哺乳动物中有33个成员,其PX结构域易与定位于早期内涵体的磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate Ptd Ins(3)P)结合,参与蛋白跨膜过程中货物分子接头蛋白与膜锚定蛋白的结合等蛋白间的相互作用,故SNXs在细胞内吞、蛋白分选、细胞信号转导、膜运输、膜重塑和细胞器运动等方面均起重要作用.不同SNXs尚含差别较大的其他结构域,据差异结构域的不同,可进一步分为3大类.其中某些成员参与肿瘤、阿尔茨海默症、神经疾病和心脏病等人类重大疾病的发生.本文概述其发现、基因定位、结构、分类、功能及相关疾病等的研究现状,并展望其相关动向.