HBV cccDNA检测方法的研究进展

目前全球约有2.57亿慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者,是当前最为突出的公共卫生问题之一. HBV感染的肝细胞内稳定存在的共价闭合环状DNA(cccDNA)是造成HBV感染持续、抗病毒治疗停药后病毒反弹的重要原因.现有Anti-HBV药物难以有效清除或直接抑制肝内cccDNA是慢性乙肝难以治愈的关键瓶颈.缺乏简单易行的cccDNA定量检测方法,影响了靶向cccDNA的Anti-HBV新药研发进展,也阻碍了这一指标在慢性乙肝患者临床管理实践中的应用. Southern blot被认为是目前cccDNA实验室检测的"金标准",但其操作复杂且灵敏度低,不适合于高通量药物筛选及临床应用.基于PCR的cccDNA检测方法相对操作简单、检测灵敏度更高,但其可靠性仍有待考验.本文系统整理分析了cccDNA样品提取和测定方法的研究现状与进展,希望通过综合比较不同cccDNA检测技术的性能和特点,为cccDNA相关基础研究、药物发展与临床研究提供方法学参考.     

乙型肝炎抗病毒药物研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)在世界范围内流行,能够引起急、慢性肝炎,其中长期慢性感染可增加肝硬化及肝癌的发病风险.抗病毒药物治疗是控制HBV慢性感染的有效方法.目前应用于临床的抗HBV药物主要有两类:α干扰素和核苷(酸)类似物.这两种药物虽然可以抑制病毒复制,减轻或消除肝脏病理损害并有效阻止病情向肝硬化和肝癌发展,但并不能有效地达到HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)使其转阴并清除病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA),所以HBV慢性感染很难治愈.近年来,随着人们对HBV研究的深入,针对其复杂的感染机制及病毒与宿主免疫系统之间相互作用的不同靶点药物被相继开发出来.本文对近年来在病毒直接靶向和宿主靶向药物(一些目前正处于临床试验阶段),以及免疫治疗药物研发方面所取得的进展进行综述.此外,还对高通量筛选技术(unbiased high-throughput screens)寻找新的抗病毒化合物,以及老药新用的策略用于抑制HBV进行了探讨.     

HBeAg阴性小鼠模型的研究现状与展望

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球肝病的重要原因之一,全球约有2.5亿患者感染HBV.其中,慢性HBV感染将导致肝纤维化(liver fibrosis),肝硬化(liver cirrhosis, LC)甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinonma,HCC). HBV感染的临床进程可分为乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)阳性和HBeAg阴性两个阶段.而长期携带和难以清除的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)是两个阶段共同的固有特征.慢性HBV感染不能完全治愈,其致命原因是没有有效药物能彻底清除cccDNA;严重瓶颈是无理想的实验动物模型,尤其是针对HBeAg阴性cccDNA小鼠模型.目前, HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者在全球范围内呈逐年上升趋势,本文就cccDNA的重要性、HBeAg基因结构及HBeAg转阴机理、HBeAg阴性cccDNA小鼠模型的研究现状与未来的应用前景进行简要述评.     

自噬在乙肝病毒引起的疾病中的功能

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属于嗜肝DNA病毒科家族成员之一,全世界约有20亿人受到HBV感染,其中约3.5亿人是HBV携带者, HBV携带者中HBV长期低水平复制导致肝炎、肝硬化和肝细胞癌的发生.在这一过程中,越来越多的证据表明自噬扮演了重要角色.本文将从HBV在自噬不同阶段的作用,以及HBV引起的肝损伤和肝癌过程中自噬的功能这几个方面进行综述,以期为深入探索HBV病毒致病机制和筛选抗病毒的靶点、研发抗病毒药物提供有效的帮助.     

CRISPR-Cas9基因编辑技术在乙型肝炎病毒治疗中的应用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)能引起患者慢性感染,增加肝硬化和肝癌的风险,是威胁全球健康的一个重要问题.核苷(酸)类似物(NUCs)和干扰素(IFN)是目前治疗HBV仅有的两类药物,然而这两类药物均无法清除稳定存在于细胞核中且能够作为模板产生子代病毒的闭合共价环状DNA (covalently closed circle DNA, cccDNA).此外, HBV耐药相关突变(RAM)和疫苗逃逸突变(VEM)降低了现有治疗和预防策略的成功率.因此,人们在努力开发直接靶向cccDNA,将之失活或清除以实现治愈慢性乙肝的治疗手段.特异性靶向HBV基因组保守区域的CRISPR-Cas9基因编辑系统,不仅能够有效抑制病毒复制,相比其他基因编辑工具,设计也更加简单灵活,成为了一个十分具有吸引力的治疗选择.本文将总结现有CRISPR-Cas9系统在抗乙型肝炎病毒中的研究,并探讨其可能面临的问题与潜在的解决方案.     

HBV cccDNA的表观遗传学修饰及调控

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个重大的世界性公共卫生问题. HBV能够引起急性或慢性病毒性肝炎,最终导致肝硬化甚至肝癌的发生.现行的临床抗HBV药物,如α干扰素和核苷(酸)类似物等,虽可有效抑制病毒复制,但不能彻底清除病毒.其根本原因在于, HBV感染肝细胞后形成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, ccc DNA),并以微染色体的形式独立稳定存在于肝细胞核内.表观遗传学修饰可在不改变DNA序列的情况下,影响基因的表达.越来越多的证据表明, ccc DNA的表观遗传学修饰是调节HBV生活周期的重要因素.本文就HBV ccc DNA的表观遗传学修饰和调控作用、表观遗传修饰药物和治疗,以及表观遗传学研究方法和体系等进行综述.     

宿主因子参与HBV cccDNA形成和转录

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起乙肝的病原体. HBV基因组是一个不完全双链环状DNA(relaxed circular DNA, RC-DNA).当HBV在宿主细胞中复制时,首先RC-DNA需要转化为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, ccc DNA),后者作为HBV的转录模板,产生病毒的亚基因组和各种m RNA.其中,pg RNA作为逆转录模板逆转录负链DNA,继而合成正链DNA,最后组装成新的RC-DNA. ccc DNA的存在是干扰素(IFNs)、核苷类似物(NAs)等药物无法彻底消除乙肝抗原、治愈乙肝的重要原因. HBV ccc DNA的形成和转录过程受到许多宿主因子的调控,本文从乙肝病毒的感染和复制特征出发,总结了在各个过程中参与HBV ccc DNA形成和转录的宿主因子,对有关HBV ccc DNA形成的具体过程以及调控机制的研究具有一定指导意义.     

HBx对HBV复制的调控

乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝细胞肝癌(HCC)发生发展的重要诱因之一. HBV在感染细胞后进行病毒DNA的复制、病毒蛋白的合成以及新病毒颗粒的包装和释放等步骤,其中病毒感染细胞逃避宿主免疫后,就可能通过HBV复制产生子代病毒、形成持续感染、诱导肝癌的发生发展.机体中HBV的复制受到多种因素的影响,而乙型肝炎病毒的X蛋白(HBx)对于HBV复制的影响是其中一个重要因素.本文在对HBx蛋白的结构组成及其分布做简要阐述的基础上,重点综述HBx通过不同的修饰途径来调控HBV的复制,以及HBx通过mi RNA来调节HBV复制的进程.     

RNA干扰介导对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区或表面抗原编码区的siRNA表达载体pSI-C和pSI-S, 在体外HBV复制细胞模型中观察对HBV复制和表达的影响. 将pSI-C, pSI-S与1.3倍HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞, 分别在转染后24, 48和72 h, 观察pSI-C和pSI-S对细胞上清和胞内病毒抗原表达的影响, 并用分子杂交方法从病毒复制、转录和翻译水平检测目的基因的表达情况. 实验结果表明, pSI-C及pSI-S能明显抑制细胞内HBsAg和HBcAg的合成, 呈序列特异性和剂量依赖性的特点, 而对照组siRNA无抑制作用. pSI-C比pSI-S抑制作用更强, 转染后第2天对HBsAg和HBeAg抑制率达高峰, 分别为92%和85%. Southern和Northern杂交结果表明, HBV siRNA能降低目的基因转录和病毒复制中间体的表达水平, 提示针对乙型肝炎病毒核心区和表面抗原编码区的siRNA能有效抑制HBV RNA分子转录和病毒复制, 最终降低病毒抗原表达, 这为运用RNAi技术进行HBV基因治疗提供了新的思路.     

呼肠病毒, 在SARS患者中分离与初步鉴定

严重急性呼吸综合征(SARS)疫情在北京造成了严重后果, 冠状病毒已被广泛认定为导致SARS的病原体. 但是临床和实验提示, SARS病因可能不是单一冠状病毒感染. 本文报道了我们从北京市第1例SARS患者和其母亲的咽拭子中分离出呼肠病毒. 在电子显微镜下, 可观察到典型的呼肠病毒. 血清学实验显示, 38例SARS患者中24例对呼肠病毒呈阳性反应. 针对呼肠病毒的基因保守序列(S2基因片段)设计引物, RT-PCR实验扩增出特异性DNA片段. 进一步DNA序列分析表明是一种独特的呼肠病毒(呼肠病毒科正呼肠病毒属). 初步动物实验显示, 该呼肠病毒可导致非典型样肺炎发生和小鼠死亡. 尽管如此, 呼肠病毒感染是否与SARS疫情有关, 还有待进一步研究才能阐明.     

用NMR方法研究杂多酸HPA-23与谷胱甘肽的作用

早在70年代初,人们就发现杂多酸具有抗病毒活性.例如钨锑酸钠[NaSb_9W_(21)O_(86)]~(18-)有可能成为潜在的抗病毒化合物.非常有趣的是最近报道[NH_4]_(18)[NaSb_9W_(21)O_(86)]·24H_2O(结构代号为HPA-23)具有很高的抗爱滋病病毒活性,在法国已进入临床应用.但从分子水平研究杂多酸化合物抗病毒的机理,目前尚未见到国内外报道.而作为病毒可以广义地看作由一个蛋白外壳包裹,内部则为核酸.爱滋病病毒同样由两层蛋白所包裹,与宿主细胞发生吸附作用主要是通过外层包络蛋白(GP120),该蛋白的活性组分是一个由8个氨基酸组成     

肝炎病毒基因组的无性繁殖获得成功

今年五月,在欧洲和美国的三个著名遗传工程实验室宣布,他们获得了B型肝炎病毒(HBV)基因组的无性繁殖系.这三个实验室是:英国爱丁堡大学麦莱(Murray)实验室、法国巴斯德研究所蒂奥莱斯(Tiollais)实验室和美国斯坦福大学科恩(Cohen)实验室. B型肝炎病毒基因组DNA的分子量约为3×10~6道尔顿,有3200碱基对,是个带有单链区和一段缺口的双链环状分子.是已知哺乳动物病毒DNA中最小的一个.它可     

随机断裂模型对7Li离子致DNA链断裂碎片长度分布的分析

用随机断裂模型分析了重离子电离辐射致质粒DNA双链断裂(dsb)的片段长度分布, 随机断裂模型中的u为平均每个DNA上的双链断裂数, 并可直接由实验得到. 分析表明在低剂量时, 随机断裂模型都不能描述DNA的碎片分布. 在较高剂量时, 随机断裂模型可以较好地符合实验结果, 说明了在较大剂量情况下, 重离子诱发的DNA碎片的长度分布具有随机统计性质.     

Vif-APO相关的HIV-1病毒模型

病毒感染因子Vif对控制HIV-1病毒的感染能力非常重要,它通过和细胞抗病毒蛋白APOBEC家族(简写成APO)的相互作用,引发APO的快速降解从而阻止APO被包装到新生的病毒粒子中.在本论文中,我们提出一个数学模型来定量地描述这种典型的病毒-宿主相互作用.为检验该模型,我们将计算模拟结果和4组已发表的实验数据进行了对比.在此基础上进行了系统的参数敏感性分析和扰动分析,表明与APO相关的参数对于新生HIV-1病毒粒子的感染能力非常重要.我们发现病毒结构蛋白Gag的生成速率以及单位新生病毒粒子所需的Gag蛋白分子数目呈现出对高病毒粒子产生速率和低APO包装入新生病毒粒子程度的优化现象,并且模型中的许多参数只在较小的取值范围内对病毒才是有益的.我们还发现针对激活病毒RNA合成的调控蛋白Tat的小扰动会导致Vif和APO包装入新生病毒粒子的量呈现开关效应.这些发现将有助于理解HIV-1病毒的高突变率和潜伏现象,并为药物设计定位关键的靶标提供帮助.     

反义核酸对小鼠腹水瘤病毒的抑制作用 Ⅱ.寡聚脱氧核苷酸对小鼠腹水瘤病毒感染整体动物的治疗作用

反义核酸(Antisense RNA and DNA)对病毒引起疾病(包括AIDS)作用的研究发展迅速,并取得了较好结果,现已成为一门独特的新领域——抗病毒化学治疗(antiviralchemotherapy)。文献[1]报道了反义寡聚核苷酸,互补于反转录病毒RNA基因 5′端引物tRNA区序列的片段,和均聚体寡聚脱氧胞嘧啶核苷酸(homooligo dC_(14) )对小鼠腹水瘤病毒SRS(M-MuLV反转录病毒之一种)的抑制效果很好,病毒感染后宿主细胞(3T3)的生长抑制达到90％。本文报道进一步用均聚体寡聚脱氧胞嘧啶核苷酸研究对反转录病毒感染后的整体动物(小鼠)的治疗作用。实验结果表明所用核酸量到较适浓度时其抗病毒疗效达到80％,此时所     

新型冠状病毒治疗药物的研究现状及展望

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)因具有极强的传染力和无特效治疗药物,导致其在全球大规模传播.目前疫苗的接种和推广一定程度上缓解了COVID-19大流行,但从临床治疗角度仍需要行之有效的治疗手段和抗病毒药物才能阻止这种新型病毒对人类健康造成的巨大威胁.由于抗病毒新药的研制周期漫长,其研发过程涉及靶点的选择、体外药效筛选、体内药理学及毒理学验证以及临床安全性与治疗效果的确认等不同阶段,才能最终获得具有临床应用价值的治疗药物.经过科研工作者的不懈努力,针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性靶点而设计和筛选的少数小分子新型冠状病毒抑制剂药物,目前已进入临床验证并取得了令人振奋的治疗效果.本文综述了COVID-19暴发以来的抗病毒热点药物,尤其是对SARS-CoV-2具有潜在治疗作用的代表性抗病毒化合物的药学分类、作用靶点、药效机制以及相关的临床测试结果.基于抗新型冠状病毒药物的研发现状进行了分析和总结,明确了药物研发人员在新型冠状病毒肺炎疫情防治工作中肩负的责任和面临的挑战,提出能有效抑制病毒感染的新药的研发方向.     

4′-硫代-2′-脱氧胸腺嘧啶核苷-5′-三磷酸化学合成及对DNA复制的影响

4′-硫代核苷类似物已有一些报道,主要是对其化学合成和药物活性的研究。人们发现它们具有一定的抗肿瘤,抗病毒的活性。但对于它们影响DNA合成的作用机制还一无所知,为了从分子水平上了解它们的生物活性并开发新的性质和用途,我们在4′-硫代-2′-脱氧核苷的基础上,合成了4′-硫代-2′-脱氧胸腺嘧啶核苷-5′-三磷酸(TsTP)并考察了它对DNA合成的影响,发现:1)TsTP能有效地抑制DNA的合成,2)TsTP对DNA合成的抑制只发生在DNA模板腺嘌呤位置上,即抑制是高度专一的。上述二个性质使TsTP既成为潜在的抗肿瘤,抗病毒的药物,又成为潜在的DNA顺序测定终止剂。     

从灭活病毒诱导的培养细胞中鉴定鱼类抗病毒相关基因

紫外线灭活的草鱼出血病病毒(GCHV)能诱导鲫鱼囊胚培养细胞(CAB)产生高滴度的干扰素并抵抗病毒入侵, 其机制可能是通过诱导一组抗病毒相关基因的表达, 而使寄主细胞建立起抗病毒状态. 利用抑制性差减杂交技术, 构建了灭活病毒诱导鱼类培养细胞基因差异表达的差减cDNA文库. 从差减文库中筛选鉴定出272个差异cDNA片段, 测序分析发现它们为69个基因, 其中46个为已知基因的同源物, 23个为未知的假定基因. 已知基因包括Ⅰ型干扰素信号通路的基因Stat1和Jak1, 抗病毒基因Mx和Viperin, 以及一系列干扰素激活基因或免疫相关基因. 23个未知的假定基因多数具有富含AU成分的序列. 虚拟Northern杂交和RT-PCR进一步证实这些基因在灭活病毒诱导的细胞中差异表达. 意味着灭活GCHV不仅能诱导CAB细胞分泌干扰素, 而且还导致一系列重要抗病毒相关基因或免疫相关基因的表达, 揭示鱼类干扰素系统的信号转导途径和抗病毒机制与哺乳类基本相似.     

新型HLA-A2限制的B, C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定

乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8+ T细胞(CTL)介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要, 已鉴定的T细胞表位绝大多数都来自A, D基因型的乙肝病毒, 而在我国流行的B, C型病毒表位研究较少. 本研究合成重叠九肽肽库, 通过细胞结合试验和体外重折叠实验系统筛选和鉴定B型和C型HBV核心蛋白表位, 发现一个在60位氨基酸由L变异成V(L60V)而产生的新表位HBcAg60-68. 表位肽能在HLA-A2/K^b转基因小鼠体内激发特异性CTL细胞免疫反应. 检测HLA-A2阳性乙肝患者表位特异性CTL证明该九肽序列为体内自然加工的表位, 这为研究HBV感染中特异性CTL免疫应答提供新的依据.     

CpG DNA增强口蹄疫病毒DNA疫苗诱发豚鼠产生的免疫应答

CpG DNA是一些具有免疫刺激作用的核苷酸序列，这些序列在DNA疫苗诱发机体产生的免疫应答中起着重要作用。设计并化学合成了一段含CpG DNA的寡核苷酸，将其插入编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶及O型口蹄疫病毒抗原表位融合蛋白的表达质粒中，并观察了其对重组质粒介导的免疫应答的影响。结果显示，插入的寡核苷酸能增强重组质粒诱发豚鼠产生的病毒中和抗体及T细胞增殖反应，并能提高豚鼠的抗病毒感染能力，证明将CpG DNA克隆进DNA疫苗中提高DNA疫苗免疫活性的一条有效途径。同时，构建的DNA疫苗为抗口蹄疫DNA疫羁的应用奠定了一定的基础。