不同聚合态胰岛素的晶体学研究:重组突变体B9(Ser→Asp)人胰岛素的系列结晶及其初步晶体学研究

用基因工程方法制备的B9(Ser→Asp)人胰岛素突变体是一种速效胰岛素.报道这一突变体的晶体生长,初步晶体学分析及衍射数据收集与处理.在不同的晶体生长条件下,分别得到了正交、四方、三方3种晶型的晶体.突变分子在不同晶型的晶体中以不同聚合方式存在,其构建单位分别是二体和六体.通过对这3种不同晶型的晶体结构解析和比较研究,将对此突变体的速效特性的结构基础以及胰岛素在不同条件下的自聚合特征有更深入的了解.     

一种含酚胰岛素新晶型的初步晶体学研究

长久以来,苯酚类试剂被作为一种保存剂广泛地出现于各种胰岛素制剂中。但其功效并没有从理论上得以阐明。1958年,Schlichkrull在不同于传统的三方二锌及三方四锌胰岛素晶体生长体系中得到单斜胰岛素晶体,其中最大的差别是体系中含有浓度为1.0％的苯酚(phenol)。1964年,Kreyenbuhl和Rosenberg也报道了苯酚和间甲基苯酚(m-cresol)是制备长效胰岛素药物胰岛素-鱼精蛋白(NPH)复合物的必需条件。至此,人们开始注意到     

两个A链改变后保留高生物活力的胰岛素类似物的初步晶体学研究

用固相合成和基因定点突变方法，分别制备了保留高生物活力的「Ａ１３－１４ＧＡＢＡ〈Ａ２１Ａｌａ」猪胰岛素和「Ａ３Ｔｈｒ」人胰岛素，结果显示，非编码的γ－氨基丁酸能够取代胰岛素中位于Ａ１３－Ａ１４ 二肽Ｌｅｕ－Ｔｙｒ；高度保守 与受体珠Ａ３Ｖａｌ可以被亲水的Ｔｈｒ取代，报道上述２个胰钫 类的的单晶体培养的和Ｘ－射线衍射的初步晶何不这研究。     

高稳定性人胰岛素的晶体学研究——Ⅰ.A21-Ser突变体的结晶和初步晶体学分析

早就发现,胰岛素在酸性溶液中是不稳定的。其主要不稳定因素,是A链C末端残基Asn对酸水解特别敏感,极易发生脱酰胺反应并形成共价连接的二聚体。由于医用胰岛素制剂的重要部分是酸性溶液,因此这构成在临床应用上药剂纯度和保存中的重要问题。特别是近年来,通过蛋白质工程途径获得了一些可溶性长效胰岛素,它们都是酸性条件下的制剂,在过渡到实际应用时都需要解决A21-Asn脱酰胺反应所产生的不稳定问题。丹麦Novo研究所的Markussen等人运用基因定点诱变方法研究了一系列A21位残基取代的突变体人     

高稳定性人胰岛素的晶体学研究(Ⅱ)——A21-Gly突变体的结晶和初步晶体学分析

一、引言 胰岛素制剂的化学稳定性与其A链C端残基A21-Asn直接相关,通过蛋白质工程途径制备在A21位残基替换的突变体胰岛素可以明显提高其稳定性。通过晶体结构分析研究这些高稳定性突变体的精确三维结构,对了解这些改性胰岛素的结构基础以及寻求最佳实用     

精氨酸~(B31)—人胰岛素的初步晶体学研究

胰岛素是迄今研究得最为广泛和深入的一种激素蛋白质,在其大量有关结构-功能关系知识积累的基础上,试图通过蛋白质工程构建新型胰岛素分子(如具有长效、高效、低免疫原性等)以改进糖尿病的临床治疗,已成为目前胰岛素研究的一个重要方向。 近年来,利用半合成和基因突变技术修饰胰岛素B链末端残基已获得明显的长效效应(如文献),深入了解这类修饰胰岛素长效作用的结构基础对寻求更优异的分子设计具有重要意义,这就需要这些衍生物的精确三维结构知识,本文报道一种经半合成制备的长效胰岛素——精氨酸-人胰岛素的初步晶体学研究。     

长效胰岛素研究——(Lys-B_(31)-NH_2)-胰岛素的结晶和初步晶体学分析

天然胰岛素在酸性溶液中是一种短时效制剂,直接用于糖尿病患者需一天注射几次。因此,寻求长效制剂从一开始就是胰岛素临床应用提出的实际课题。经过相当时间的探索,已有一些长效制剂成功地用于临床。但目前广泛使用的长效胰岛素大多是通过引入外源蛋白和有机化合物(如鱼精蛋白胰岛素),或改变胰岛素的物理状态(如结晶Zn-胰岛素)来产生长效效应。由于含有外源因素,这类制剂在实际应用中有明显的缺点,如产生免疫反应、过敏反应、毒性等。蛋白质工程的出现,促使研究者努力通过胰岛分子本身的改造去寻求新型长效制剂,其主要特点是通过分子内在因素制导产生长效性,而无需外源物。为此目的,我们从1987     

天然胰岛素及其突变二聚体对盐浓度和pH值的依赖性

基于形式电荷（formal charge）参数设置，用有限差分泊松－玻尔兹曼方法（FDPB）来预测蛋白质结构的稳定性，以人的2Zn天然胰岛素及其速效突变体B9D（B9Ser→Asp），B9E（B9Ser→Glu），B9EB10D（B9Ser→Glu，B10His→Asp）和B10D（B10His→Asp）为研究对象，研究了溶液中不同pH值及盐离子浓度对天然胰岛素和突变体稳定性的影响，阐明了这些突变体具有速效特性的结构和理论基础。计算结果与实验相吻合。     

A1-(D-丙氨酸)胰岛素初步晶体学研究

活力不同的胰岛素以及—级结构上不同部位化学修饰的胰岛素和围绕各种不同稳定性或不同效率而进行的分子改造胰岛素的研究是目前阐明胰岛素结构与功能之间关系的最有效手段之一.研究结果表明:在维持胰岛素生物活力上,胰岛素A链N端A1-Gly有举足轻重的作用.Krail和Geiger等人曾先后对胰岛素A链N端A1-Gly用不同构型的氨基酸取代,制备了一系列Al-位置由不同氨基酸残基置换的胰岛素修饰物,以探讨它们与生物活力之间的关系.用L和D构型氨基酸取代A1-Gly以后,所有L构型氨基酸取代的修饰胰岛素的活力严重降低到原胰岛素生物活力的10%左右,而所有由D构型氨基酸取代的胰岛素修饰物     

用蛋白质二硫键异构酶研究人胰岛素原二硫键的重组

蛋白质二硫键异构酶(PDI,Protein Disulfide lsomerase)是一种亚基分子量为57kD的二聚体蛋白,它催化蛋白质巯基和二硫键的交换反应,一般认为它参与细胞内蛋白质天然二硫键的形成。我们曾用PDI研究过胰岛素A,B链的重组,在合适的条件下,PDI使二硫键错接的胰岛素或S-磺酸型胰岛素A,B链以25—30％的产率生成胰岛素,以及使S-磺酸型Al-B29交联胰岛素以90％的产率生成含有天然二硫键的交联胰岛素。尽管还原的胰岛     

Gly~(B30)-人胰岛素——一种低抗原性胰岛素的初步晶体学研究

目前,免疫反应仍然是各种胰岛素制剂在临床应用中有待解决的问题,即使应用高纯度胰岛素来治疗糖尿病,也有约7096的患者在使用一段时间后会产生抗胰岛素抗体。因此,了解胰岛素免疫反应的分子基础,寻求既有低抗原性又保有充分生物活力的胰岛素制剂,在理论和实际上都有重要意义。同时,任何修饰胰岛素在用于实际临床时,也都会遇到免疫问题,因而在通过蛋白质工程途径寻求长效、高效等改性胰岛素的同时,必须了解其免疫特性,在这些     

有机试剂对胰岛素晶体生长的影响

当前,用X射线单晶衍射方法研究生物大分子三维结构的重大难题之一是获得生物大分子晶体。生物大分子晶体生长的要害是寻找出可用于X射线衍射分析用的单晶体的最佳生长条件。在晶体生长条件的摸索中,选择有机试剂的种类和浓度一直是人们所关注的问题。 为了考查有机试剂对蛋白质晶体生长的影响,我们选择了不带电荷、对晶体生长体系     

[A21~(Ser)-B27~(Arg)-B30~(Thr)-NH_2]-人胰岛素突变体的结晶和四方晶体的晶体学研究

一些实验结果表明,蛋白质位点突变的效应具有加和性.[A21~(Ser)-B27~(Arg)-B30~(Thr)-NH_2]-人胰岛素(以下简称SRN-HI)是根据这种思想,通过蛋白质工程途径制备的一种多位点突变体.实验结果证实,SRN-HI既具有由突变A21(Asn→Ser)产生的高稳定性,同时又具有由     

B链氨端去三肽(B1-B3)猪胰岛素的初步晶体学研究

晶体结构的研究表明,三方二锌猪胰岛素分子的B链N端肽段呈一种伸展结构,并相当程度地露于分子的表面,运动性较大。随着周围溶液环境的改变,如在四锌胰岛素中所表现的那样,其取向可做较大幅度的改变,其中分子Ⅱ中的Bl-B8残基由原来的伸展变为α-螺旋,由于B链N端肽段的一级序列,尤其是其中的B1-B3残基,在不同种属中的变化较大,一段时间以来,占主导的看法是认为它与分子的免疫活性相关,而与其生物活性关系不大。Des-Phe~(Bl)-Ins的研究结果支持了这一观点,它几乎保留了天然胰岛素的全部生物活性,同时免疫活性明显下降。但是,随着研究的继续深入,有关Des-(Phe-Val)~(Bl-2)-pig Ins,Des-(Phe-ValAsh)~(Bl-3)-pig Ins,Des-(Phe-Val-Asn-Gln)~(B1-4)-human Ins,Des-(Phe-Val-Asn-Gln-His)~(B1-5)-human Ins等的研究表明,这系列衍生物的生物活性随着N端氨基酸的逐步减少而明显下降。因此,人们越来越认为B链N端残基可能直接参与和胰岛素受体的相互作用。     

形态发生之美丽

人类对形貌和结构之美的探索不止于自然界更延伸到科学领域,我们更关注的是蕴藏在形态和模式中的物理规律和应用价值。随着非线性科学的出现,形态和模式的研究再次成为科学研究的焦点,晶体可以在非平衡体系中生长出骸晶和枝晶等特殊形态的晶体,表面活性剂及模板分子的应用极大地丰富了晶体的结构和形貌。本文评述了部分晶体生长理论和不同条件下的形态发生图样。     

[Leu]~(B_1)胰岛素的晶体生长及初步晶体学观察

晶体结构研究表明,三方二锌猪胰岛素分子的B链位于分子表面,呈伸展构象,和附近近的A_(13) Leu、A_(14) Tyr等残基有序地排布在一起。在胰岛素六聚体空间结构模型中,这些残基与相邻的另一个二聚体同样的残基靠近,共同组成了二聚体间的疏水相互作用。这一区域的变动可能会直接影响到胰岛素六聚体的形成过程和以胰岛素六聚体为堆积基础的结晶性质。     

胰岛素样生长因子—Ⅱ受体的结构：一个扩大了的“谜”

胰岛素样生长因子—Ⅱ(IGF-Ⅱ)是和胰岛素及胰岛素样生长因子—Ⅰ(IGF-Ⅰ)有相似结构的一种多肽激素。与其他激素所不同的是,IGF-11在活体内的功能是未知的。IGF-Ⅱ虽可在分离的细胞内对广泛的生物反应有促进作用,但发现它的这些作用通常是受胰岛素和IGF-Ⅰ受体所调解。最近发现IGF-Ⅰ[     

高湿度环境下衬底表面对牛胰岛素聚集的影响

利用原子力显微镜观察了牛胰岛素(bovine insulin)在高湿度环境下(相对湿度大于90%)、在4 种不同衬底表面上的聚集行为. 在高湿度环境下, 衬底表面会形成一层纳米级水膜, 牛胰岛素分子会在水膜中扩散、迁移、聚集. 原子力显微镜观察表明, 牛胰岛素在不同衬底表面呈现出形式多样的聚集状态: 在MICA 表面形成排列比较规则的纤维; 在APS-MICA表面呈现出较杂乱的聚集状态; 在高温热解石墨(HOPG)表面蛋白分子主要吸附在HOPG 的台阶上, 堆积成高点并沿着台阶呈线状排列; 在OTS-MICA 表面, 部分区域出现团聚, 小部分聚集成纤维状. 这些结果表明: 在高湿度条件下, 不同衬底表面对牛胰岛素的聚集有很大影响, 可以利用不同性质的衬底表面来调制牛胰岛素的聚集.     

不同条件下胰岛素别构中间体(T3R3)的初步晶体学分析

近年来对于胰岛素基本属性认识的一个重要进展,是X射线结构分析和波谱解析等揭示它具有经典别构蛋白的特性。已发现其单体具有T,R(或R~f)构象,其六聚体则表现出3种构象态:T_6,T_3R_3(或T_3R_3~f)及R_3。胰岛素T结构与R结构的区别在于:B链的B1-B8在     

微孔晶体的晶化

从宏观和微观角度简要总结了微孔晶体晶化过程及晶化机理的研究,包括微孔晶体的成核与晶体生长(宏观角度)、晶化机理的主要观点、结构导向效应、研究微孔晶体晶化的主要技术手段及最新的研究思路和策略(微观角度).借鉴于致密晶体晶化行为的研究,微孔晶体的晶化过程分为成核与晶体生长两个阶段.在成核阶段,提出了晶核可以从液相(液相成核)、固相(固相成核)或固液相(双相成核)中成核,后被统一为"通用"成核机制.在晶体生长阶段,研究主要集中于生长模式.受制于当前较低分辨率和灵敏度的表征手段以及合成体系的复杂度,人们对晶体的成核与生长机制的认识还存在着极大的争议.在微孔晶体的晶化过程及晶化机理研究中,一项重要的内容是通过特定的表征手段确认在晶化过程中生成的小结构单元,包括色谱、电喷雾质谱、原位和非原位核磁共振、紫外拉曼光谱等.结合实验数据和理论计算可以确定一些单靠实验数据不能确认的结构单元.在微孔晶体的晶化过程中,结构导向剂起到了极其关键的作用.本文简要总结了结构导向剂的种类和导向的典型结构.最后介绍了新近提出的"反向进化"法,该方法可用于研究在晶化的早期阶段生成的小结构单元及晶化起点的结构.