盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出蚕豆盐胁迫下不同组织中表达稳定的内参基因,本研究以不同浓度氯化钠胁迫下的蚕豆叶片、茎、根为材料,利用实时荧光定量PCR技术检测ELF1 A、ACT2、GAPA、18S rRNA、TUA和CYP2六个候选内参基因的表达情况;通过Ct值分析、及GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件综合分析候选...     

扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用

实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-seq数据，挖掘和注释了694个稳定表达的候选内参基因；随机挑选出Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase在内的14个基因，以4、25℃条件下PDB培养基生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌为材料，进行实时定量PCR实验。实时定量PCR数据基于geNorm和NormFinder 2种软件的综合分析，表明Isy1、Spt5、Nucb、Hp1适合作为内参基因。以Isy1和Spt5分别作为内参基因，检测Gh30基因在4、25℃条件下扩展青霉菌生长发育过程中的基因表达，显示出一致的基因表达水平，进一步验证了挖掘得到的内参基因的可靠性。该研究为扩展青霉菌的分子生物学研究提供了优良的内参基因，同时提供了一种高效的内参基因的挖掘和鉴定方法。     

工业大麻种子萌发及渗透胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选适用于工业大麻种子正常萌发与渗透胁迫下萌发的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)内参基因,研究以‘云麻7号’种子为试验材料,设置正常萌发和20%PEG渗透胁迫下萌发处理.利用qRT-PCR技术对10个候选参考基因（CDPK,e IF4E,TIP41,UBQ,EF1α,PP2A,Actin,Clathrin,TUB,DHS2）在3个萌发时间点（萌发3、5、7 d）幼苗中的表达量进行检测.通过GeNorm、Normfinder和BestKeeper三种软件包对内参基因表达稳定性进行评价,再利用RefFinder在线软件进行综合分析,从而获得稳定、适宜的内参基因.结果表明,在工业大麻种子正常萌发过程中,PP2A基因的稳定性最好.在渗透胁迫下的种子萌发中,UBQ基因的稳定性最好.综合两组结果得出,eIF4E内参基因的表达最稳定.研究结果确定了工业大麻种子萌发及渗透胁迫下进行qRT-PCR分析的最适内参基因,为今后研究工业大麻种子萌发响应渗透胁迫相关基因的表达提供前期基础.     

干旱、盐胁迫对济麦22生长及CKX4基因表达的影响

为探究逆境胁迫对小麦生长发育以及CKX4基因表达情况的影响,以济麦22为试验材料,测定不同浓度PEG干旱胁迫和NaCl盐胁迫下济麦22的生长量、叶绿素含量、根细胞活力、叶绿素荧光参数以及TaCKX4基因表达量。结果表明:胁迫处理后的各生理指标与对照相比差异具有统计学意义,其中40%PEG胁迫下济麦22幼苗长势最差;济麦22 PSⅡ的实际量子产量(Y(Ⅱ))和光化学淬灭系数(qp)均表现为随着处理溶液浓度增加而降低的趋势;重度干旱和盐胁迫下TaCKX4基因表达量各自组间的差异均具有统计学意义,分别在0.5和1 h转录达到最高水平,基因均上调5倍左右,表明小麦受胁迫24h内CKX4基因表达上调,促进细胞分裂素降解以保证植株正常生长发育。本研究通过测定干旱和盐胁迫下济麦22的生长发育以及CKX4基因的表达情况,发现其外在表型、内在生理和CKX4基因表达均受到显著影响,验证了CKX4基因通过上调表达量抑制细胞分裂素累积,促进根的生长发育和对养分的吸收而适应逆境,可对后续研究耐逆性强的优质小麦提供数据和理论支持。     

小苍兰实时荧光定量PCR中的内参基因筛选

筛选适用于小苍兰实时荧光定量PCR的内参基因，为准确研究小苍兰基因表达，尤其是种球发育相关基因的表达分析提供参考。     

18S rRNA作为植物实时荧光定量PCR内参基因的探究

实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)已广泛用于基因表达分析,而内参基因的选择对qRT-PCR定量分析的数据校正起关键作用.以18S rRNA作为小麦、苜蓿和杜鹃qRT-PCR的内参基因,探究其表达丰度是否适合作为这3种植物的内参基因.结果表明18S rRNA在这3种植物中的表达丰度均过高,Ct值均小于15,影响目的基因定量的准确性.因此,在目的基因的表达量低时,18S rRNA不宜作为这3种植物的内参基因.     

实时荧光定量PCR检测疫霉侵染下辣椒nsLTP基因的差异表达

采用实时荧光定量PCR方法测定了辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)胁迫下辣椒抗病基因nsLTP的转录水平变化.结果 表明:与对照相比,疫霉胁迫下nsLTP基因表达量随着胁迫时间延长呈现出先升高后降低再升高的变化特点,该基因在早期被诱导表达,在胁迫6 h后表达量达到最大值,之后明显下降,相对表达量变化...     

实时荧光定量PCR检测疫霉侵染下辣椒nsLTP基因的差异表达

采用实时荧光定量PCR方法测定了辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)胁迫下辣椒抗病基因nsLTP的转录水平变化.结果 表明:与对照相比,疫霉胁迫下nsLTP基因表达量随着胁迫时间延长呈现出先升高后降低再升高的变化特点,该基因在早期被诱导表达,在胁迫6 h后表达量达到最大值,之后明显下降,相对表达量变化范围为2.38～15.53.     

授粉后红球姜雌性生殖器官qRT-PCR的内参基因筛选

在研究分析红球姜（Zingiber zerumet (L.) Smith）败育关键调控基因的表达中，筛选授粉后雌性生殖器官发育过程中的内参基因至关重要。本研究根据授粉后不同时间点的红球姜转录组数据库以及相关文献报道的传统内参基因，筛选出10个表达相对稳定的基因Actin-2（ACT2）、Actin-7（ACT7）、Beta tubulin-1（TUB1）、Beta tubulin-5（TUB5）、Alpha tubulin-3（TUA3）、Ubiquitin（UBQ）、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Elongation factor 1-alpha（EF-1）、Cyclophilin（CYP）、Histone（H2A）作为候选内参基因，采用qRT-PCR技术，结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析。结果表明，在红球姜雌性生殖器官授粉后的发育过程中，GAPDH和UBQ的表达稳定性最好，均适合作为内参基因，且同时使用两种作为内参基因能使实时荧光定量PCR标准化分析结果更精确。因此，最终选择GAPDH和UBQ作为实时荧光定量PCR标准化分析红球姜雌性生殖器官相关基因表达的内参基因。本研究将为探究红球姜败育的分子机理奠定基础，也为近源姜属植物内参基因的筛选提供线索。     

杂色鲍幼虫变态及TR干扰下内参基因的筛选

内参基因的稳定性对实时定量PCR的结果影响巨大。采用Ge Norm、norm Finder和Ref Finder三款软件比较了鲍变态和干扰幼虫甲状腺激素受体(TR)两种情况下内参基因的稳定性。软件分析了EIF5A、OAZ1、YB1、RPL3、RPS9和ACT等6个候选内参基因的C_t值,据此获得各基因的稳定值。在杂色鲍幼虫的变态过程中,EIF5A稳定性最高,排名平均数为1,表明该基因可以作为这一阶段实时定量PCR的内参基因,但是在干扰TR情况下,EIF5A的稳定性下降,排名平均数为3.91。RPS9则与之相反,在变态过程该基因表达稳定性最差,而在干扰TR时表达稳定性最好。ACT在两种情况下稳定性较好,排名平均数均位列第二位,可以作为这两种情况下的通用内参基因。其他基因的稳定性在这两种情况下也发生剧烈变换。这表明内参基因的稳定与样品具体处理情况关系密切。为了保证定量PCR结果的准确性,需要针对具体处理情况相应地进行内参基因的稳定性评估。     

聚乙二醇(PEG)胁迫诱导水稻DNA甲基化变异与脯氨酸代谢相关性研究

干旱胁迫经常伴随着植物脯氨酸代谢的变化.为了研究干旱胁迫条件下脯氨酸的累积与DNA甲基化变异之间的相关性,采用聚乙二醇(PEG)模拟天然的干旱胁迫条件,以15%聚乙二醇(PEG)胁迫处理的水稻幼苗为实验材料,利用DNA甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)筛选出1株甲基化变异最大的单株(S0);采用Southern印迹杂交(Southern blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime-PCR)分别检测S0和S1代(S0自交产生的后代)与脯氨酸代谢相关基因的DNA甲基化变异和基因表达的变化情况,并测定了S0和S1代叶片游离脯氨酸的含量.结果表明:S0代谷氨酸合成途径的相关基因没有发生甲基化,S1代谷氨酸合成途径的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因在后代(14个单株)全部发生了CHG去甲基化变异,变异率为100%.鸟氨酸合成途径的鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)基因在后代中有3个单株发生了去甲基化变异,变异率为21%;Δ1-吡咯琳-5-羧酸脱氢酶(P5CDH)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)基因的甲基化没有明显变异,变异率为0.Realtime-PCR结果表明:S1代P5CS基因表达上调率为100%;δ-OAT和P5CR基因S1代14个单株中有10个单株的表达发生了上调,上调率为71.4%;降解途径中的关键基因P5CDH基因S1代表达下调率7.1%.研究结果表明DNA甲基化变异与基因表达之间可能仅在部分基因上存在一定的关联性.     

六溴环十二烷胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因稳定性分析

【目的】筛选出不同浓度六溴环十二烷(HBCD)胁迫下红树蚬(Polymesoda erosa)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的最适内参基因,用以准确校准目的基因的表达,为进一步开展分子毒理研究和开发分子生物标志物奠定基础。【方法】通过荧光定量PCR技术监测候选内参18S核糖体RNA(18S rRNA)、β-肌动蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α-微管蛋白(α-tubulin)等管家基因,在红树蚬各组织受不同浓度(0μg/L、0.86μg/L、8.6μg/L)六溴环十二烷(HBCD)胁迫后的表达量,利用qRT-PCR及geNorm、NormFinder、BestKeeper等分析软件对不同条件下的表达数据进行处理,从而筛选出适合荧光定量PCR的最佳内参基因。【结果】受不同浓度HBCD胁迫后,鳃及肝胰中各管家基因的表达稳定性排序整体为β-actin=α-tubulinGAPDH18S rRNA。【结论】可单独或共同使用两个内参基因(β-actin、α-tubulin)校准荧光定量结果。     

Elf-1基因在急性髓细胞性白血病中的表达情况

目的:建立实时定量PCR检测Elf-1基因表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血Elf-1基因表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测33例AML患者:M2型17例、M3型6例、M5型10例和20例健康人外周血的单核细胞的Elf-1表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用公式2~(-△Ct)×100%计算Elf-1基因表达水平.结果:AML组Elf-1表达水平(13.518±19.197)%明显高于健康对照组(2.044±1.321)%(P<0.01),不同AML亚型之间Elf-1的表达水平没有显著性差异(P=0.52),但各亚型AML的Elf-1的表达水平均与健康对照组比较均有显著性差异(P<0.01).结论:建立SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR分析外周血Elf-1表达水平的方法,检测急性髓细胞性白血病Elf-1基因高表达情况.     

多氯联苯胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出多氯联苯(PCBs)胁迫下红树蚬(Polymesoda erosa)的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)最适内参基因,为进一步开展分子毒理学研究奠定基础。【方法】以β?actin、18S rRNA、GAPDH和#?tubulin为候选内参基因,qRT-PCR测定PCBs胁迫下4个候选内参基因在红树蚬外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺组织中的表达水平,应用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析其表达稳定性。【结果】geNorm软件分析表明β?actin表达最稳定;NormFinder软件分析发现,外套膜、鳃和肝胰腺组织中β?actin的稳定性最好,闭壳肌组织中β?actin(0.454)表达稳定性略微低于#?tubulin(0.425),排第2位;BestKeeper软件分析表明,外套膜和鳃组织中β?actin最稳定,肝胰腺和闭壳肌组织中GAPDH最稳定,β?actin排位第2位。【结论】筛选β?actin为红树蚬在PCBs胁迫下的qRT-PCR最适内参基因。     

AtVDAC2参与拟南芥盐胁迫信号应答过程

为了探索VDAC在盐胁迫信号传递途径中可能的传递关系,以AtVDAC2转基因拟南芥过量表达和抑制表达株系为材料,初步探索盐胁迫过程中该基因参与信号传递的方式.实验分析了NaCl处理对种子萌发的影响、Ca²⁺对NaCl胁迫下种子萌发的影响,以及NaCl对气孔运动的影响和盐胁迫相关基因的表达水平.实验结果指出,AtVDAC2基因表达水平变化影响了拟南芥对NaCl的敏感性:高表达的AtVDAC2使得拟南芥种子对NaCl敏感性提高,种子萌发率降低,气孔关闭较快;而低表达的AtVDAC2使得拟南芥对NaCl敏感性降低,种子萌发率高,气孔不易关闭.在NaCl胁迫下添加Ca²⁺,提高了敏感株系种子的萌发率,因而推测Ca²⁺帮助AtVDAC2转基因拟南芥过量表达株系平衡下游的胁迫应答.用实时荧光定量PCR检测盐胁迫应答相关基因SOS1,SOS2的表达水平,发现AtVDAC2的高表达引起了下游应答基因SOS1,SOS2表达水平的相应提高;相反AtVDAC2的抑制表达则导致SOS1,SOS2表达水平下降.由此说明,AtVDAC2参与了拟南芥盐胁迫应答过程.     

大鼠促红细胞生成素受体基因克隆及其在颅脑损伤模型中的表达分析

利用巢式PCR(nest PCR)的方法克隆大鼠促红细胞生成素受体基因.该基因ORF区全长1 524bp,编码507个氨基酸,推测其相对分子质量为55.48ku,等电点5.07.实时荧光定量PCR结果显示:大鼠早期颅脑损伤中,EPOR基因表达呈逐步上升趋势,颅脑损伤后24h表达量达到顶峰,为对照组的6倍.     

铵胁迫下Bacillus aryabhattai NM1-A2脂质代谢的多组学分析

为了探究脂质代谢在抵抗铵胁迫中的具体作用,本研究以一株高耐铵菌株Bacillus aryabhattai NM1-A2为研究对象,通过全基因组和转录组分析挖掘脂质代谢通路和关键基因,利用实时荧光定量PCR对筛选的差异表达基因进行定量分析,并测定丙二醛含量和抗氧化酶活性.结果表明,铵胁迫下脂肪酸合成相关基因（accC、fabG和fabF等）均上调表达,脂肪酸降解相关基因（ACSL、fadB和fadN等）大多下调表达,可能导致脂肪酸积累.醛脱氢酶编码基因ALDH上调表达以减少脂质氧化产物的积累.此外,铵胁迫诱导超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶表达水平和活性的提高,以减少活性氧产生和细胞损伤.因此,活跃的脂质代谢和抗氧化酶系统是B. aryabhattai NM1-A2抵抗铵胁迫的重要途径.     

油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.     

水分胁迫下马铃薯萌芽出苗期 根系转录组差异表达分析

以马铃薯‘克新1号’为材料,通过Illumina HiSeqTM 4000高通量测序技术,对不同水分胁迫后的马铃薯萌芽出苗期根系cDNA文库进行了RNA-Seq分析,拟探明马铃薯感应水分胁迫的分子机制,挖掘出与抗旱密切相关的功能基因.将比对到基因组上的基因利用RPKM衡量各样本间的基因表达丰度,以P0.05筛选出差异表达基因,通过GO (基因本体,gene ontology)数据库、KEGG代谢途径数据库,对不同水分胁迫样本差异表达基因的功能和参与的调控路径进行分析;选择6个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证RNASeq结果的可靠性.结果表明:(1)DLWR(重度水分胁迫)样本中,比对到基因组的表达基因30 114 133个,差异表达基因5 241个;LWR(中度水分胁迫)样本中,比对到基因组的表达基因32 858 890个,差异表达基因1 488个.2个样本中同时存在的差异基因369个,其中上调表达基因78个,下调表达基因291个;显著差异表达基因主要与蛋白激酶、水解酶、氧化还原酶、水通道蛋白、转运蛋白、转录因子等相关.(2)在GO富集分析中,2个水分胁迫处理样本在生物学功能中富集的类别并不完全相同,但显著富集的主要是与氧化还原、转运、膜结合、转录调节子等相关的基因.(3)KEGG代谢分析显示,差异表达基因显著富集在谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导等途径,与植物抗逆能力密切相关.(4)利用qRT-PCR验证的6个基因表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性.通过研究得到了不同水分胁迫下马铃薯根系转录组信息,获得了差异基因及其功能信息,阐明了差异基因所参与的代谢通路及与植物水分胁迫的关系.     

青海茄参不同部位内参基因表达稳定性分析

为探究青海茄参不同部位稳定表达的内参基因,本研究以青海茄参根、茎、成熟果实及成熟叶片为试验材料,选取6个内参基因(Actin7-NT、18S rRNA、TUA、ELF4、ELF6和GAPCP2),采用实时荧光定量qRT-PCR技术,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt及RefFinder 5种方法分析候选内参基因的表达稳定性,筛选青海茄参中稳定性最佳的内参基因。结果表明：18S rRNA为青海茄参根及成熟叶片中最佳稳定内参基因,ELF4为青海茄参茎及成熟果实中最稳定的内参基因。综合分析结果为青海茄参不同组织中表达最稳定的内参基因是Actin7-NT,该结果可为后续挖掘青海茄参相关基因及代谢、蛋白等功能分析提供理论依据。