棉花黄萎病菌遗传转化载体构建和农杆菌转化

载体构建是建立真菌遗传转化体系的基础。本研究以pCAMBIA1305.1双元载体为基本骨架,构建棉花黄萎病菌遗传转化T-DNA质粒双元载体,通过限制性内切酶酶切、补平、连接以及去磷酸化等措施将pCAMBIA1305.1上Hygromycin抗性基因的CaMV 35S启动子替换成构巢曲霉的trpC启动子。经大肠杆菌转化后对转化子进行酶切验证,并将新构建的载体1305-3分别转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105。为农杆菌介导的黄萎病菌遗传转化体系的建立和优化提供了存在于不同农杆菌菌株中的供试载体。     

果实特异表达芪合酶基因的表达载体构建及农杆菌重组

本研究利用基因工程技术构建了附加果实特异表达启动子的芪合酶基因植物表达载体，并通过农杆菌直接转化技术将其转入LBA4404、EHA105，并采用PCR及限制性酶切分析对所获得的农杆菌工程菌株进行鉴定。为利用芪合酶基因转化植物并在食用果实中产生白藜芦醇做准备。     

农杆菌介导东方百合“西伯利亚”遗传转化体系建立

以东方百合"西伯利亚"(Lilium seberia)为材料,建立了百合再生和农杆菌介导的遗传转化体系.采用LBA4404和GV3101菌株对鳞片来源的愈伤组织进行侵染,并以鳞片作为对比转化材料,两种菌株携带有相同的双元载体pCAMBIA1301.研究结果表明,农杆菌侵染愈伤组织外植体转化率较高;乙酰丁香酮(AS)的添加能大大提高根癌农杆菌转化百合的效率.另外,共培养时间、不同菌株均对转化效率有一定的影响.筛选后获得的抗性植株经PCR检测和GUS组织化学染色证实外源基因已经整合到基因组DNA中并获得表达,转化率为5%～8%.     

根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究

利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simpli-cissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化

以玫瑰茄无菌苗的子叶和下胚轴为受体材料,农杆菌LBA4404和EHAl05为供体菌株,对玫瑰茄细胞外植体遗传转化的基本条件进行研究,建立了一个高效的玫瑰茄细胞遗传转化体系．利用这一转化体系获得了2个稳定表达新霉素磷酸转移酶活性的玫瑰茄转化细胞系．β-葡萄糖苷酸酶活性的组织化学检测和PCR扩增鉴定的结果表明,外植体总转化率达29．4％．试验结果还显示农杆菌LBA4404菌株较适合玫瑰茄外植体的转化,转化时不需添加乙酰丁香酮．     

原球茎为转化受体的农杆菌介导石斛遗传转化

以携带双元载体pCAMBIA1305.1的农杆菌菌株EHA105转化石斛种子萌发形成的原球茎,通过GUS瞬时表达检测对受体状态、农杆菌活化条件、共培养时间等转化影响因子进行了优化;共培养4 d的原球茎接种到含有30 mg/L潮霉素(Hyg)和500 mg/L头孢噻肟钠的愈伤组织诱导与增殖培养基上以获得潮霉素抗性的愈伤组织,抗性愈伤组织在含Hyg 50 mg/L的再生培养基上再生植株,抗性株经GUS组织化学、PCR和PCR-southem blot检测证明为转化株。     

根癌农杆菌电击转化条件的研究

探索了根癌农杆菌EHA105的高效转化方法.将双元载体质粒pBIN19/glgB经电击转化法导入根癌农杆菌EHA105,研究不同实验条件对转化率的影响.结果表明:在细胞浓度OD600为1.0时进行电转化,转化率最高,达到每微克DNA1.12×105CFU;当电场强度为11 kv/cm,转化率最高,达到每微克DNA1.78×105CFU;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细胞浓度密切相关,转化率随着细胞浓度的上升而上升;质粒大小能影响电击转化率,转化率随着质粒的增大而下降.应用该优化的电击转化条件将双元载体质粒pBIN19/glgB成功导入根癌农杆菌EHA105,构建了植物双元表达载体.     

以提高乙肝病毒表面抗原表达量和免疫原性为目的的番茄果实特异表达载体的构建

为了提高乙肝病毒表面抗原基因在番茄果实中的表达量和免疫原性,采用克隆的E8番茄果实特异表达启动子和乙肝病毒表面抗原M蛋白基因构建了植物表达载体pBIES2, 及只含有乙肝病毒表面抗原S蛋白的表达载体pBIES,并将它们分别导入根癌农杆菌LBA4404中.最后对该载体的优越性进行了讨论.     

根癌农杆菌介导的百脉根遗传转化体系的优化研究

百脉根(L otus corn icu la tus L.)是世界著名的多年生优良豆科牧草之一,也是常见的庭院观赏植物.本文通过比较不同根癌农杆菌转化百脉根的效率和优化百脉根子叶遗传转化的条件,建立了一套有效的遗传转化体系.实验结果表明,EHA 105作为宿主菌对百脉根进行转化较LBA 4404和GV 3101具有更高的转化率;5 d苗龄的子叶最适合作为转化的外植体;浸染过程中0.05 M Pa负压处理5 m im以及在共培养培养基中添加20 m g/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经3次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PCR-Sou thern杂交,证实PCR产物真实可靠,表明外源基因已整合进入百脉根基因组中.     

农杆菌介导的胆碱脱氢酶基因(betA)转化小麦及影响转化效率的因素

用LBA4404／pCDH，Agl 1／pUNN2和Ag;P(无质粒)3种菌株分别转化小麦品种济南177、99P、核生3号幼胚诱导的愈伤组织以及济南177的幼胚．其中以胚性愈伤组织为外植体，获得了转基因植株．PCR和PCR-Southem分析证实转化植株中包含了外源基因．通过染色体分析，发现胚性愈伤组织在农杆菌LBA4404侵染后形成的染色体削减比经Agl1侵染和未经感染的对照形成的染色体削减程度更大，甚至发现较多的染色体断片．分析了农杆菌菌株，材料的基因型，外植体类型，培养时间和温度以及筛选的时间和周期对于转化效率的影响．     

草莓多聚半乳糖醛酸酶基因RNAi植物表达载体的构建及表达鉴定

从草莓叶片中克隆到多聚半乳糖醛酸酶基因的1个281bp片断,构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体,经测序证实连接正确后,克隆到植物表达载体p2300121中的GUS基因位置并经双酶切证实,得到RNAi表达载体。采用直接转化法将PG2300121导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经PCR方法鉴定,证实了该基因已导入烟草基因组中。     

农杆菌介导的AtPCS1基因转化陇东苜蓿的初步研究

利用植物表达载体pBI121-AtPCS1转化农杆菌LBA4404,经菌落PCR鉴定获得阳性菌,利用叶盘法以重组的农杆菌侵染陇东苜蓿的子叶.采用GUS组织化学染色和对部分转基因再生植株进行PCR鉴定,初步结果表明AtPCS1基因已成功整合到苜蓿基因组.     

OsCHX1基因克隆及转基因植株获得

利用RT-PCR扩增水稻的Na 、K 、/H 反向转运蛋白(OsCHXl)基因全序列,将其与35S启动子连接后,插入到pl301中,构建植物过量表达载体pl301-35S-OsCHXl-NOS.将该质粒转化农杆菌EHA105,并对水稻愈伤组织进行转化,获得了再生植株.对再生植株进行GUS和PCR鉴定,发现超过85%的再生植株为阳性植株.此研究结果为进一步探讨OsCHX1基因功能提供了实验材料.     

水稻磷转运蛋白基因OsPht1;6启动子表达载体转化系统的建立

通过PCR从粳稻（Oryza sativa L.cv.ssp.Japonica）的总DNA中扩增出一个磷转运蛋白基因（Phosphates transporter1；6；OsPht1；6，accession no AF536966）的启动子序列.以此为基础与二元表达载体PS1aG-3构建含Pht1；6启动子的植物表达载体，并通过根癌农杆菌介导转化了水稻武运粳7号品种.同时，对其愈伤组织高效再生体系和影响报告基因GUS瞬时表达的各种因素也做了比较研究.结果表明：①诱导水稻武运粳7号品种愈伤形成，3 mg/L 2，4-D的生长素浓度最适宜；②GUS基因高瞬时表达频率的条件为：工程菌液的浓度OD600值为0.7-0.8，浸染时间30 min，共培养时间3 d.利用这些再生转化条件，以EHA105为菌株转化浸染愈伤组织，获得了较高频率的Pht1；6启动子驱动的GUS基因瞬时表达.这些方法都有效地提高了抗性愈伤组织的形成率，该实验获得了转基因植株，经PCR检测，证实已将目的基因整合到水稻的基因组中.     

甘草水通道蛋白PIP1基因正义和反义表达载体的构建

根据已报道的GuPIP1基因序列设计特异引物,克隆甘草水通道蛋白GuPIP1基因cDNA序列,将该片段正向、反向分别插入植物表达载体pMBW330的CaMV35S启动子和OCS终止子之间,构建了正义、反义表达载体．通过双酶切、PER和DNA测序鉴定后,分别导入农杆菌EHA105中．     

苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建和对烟草的转化

将苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV-Ch)的复制酶P2亚基(90 kD蛋白)基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROKⅡ中，得到重组植物表达载体pAIMV-FL．用三亲融合法导入农杆菌LBA4404，并转化烟草，经PCR检测，获得了含全长cDNA的转基因烟草植抹．     

农杆菌介导AtPCS1基因转化苜蓿

利用RT—PCR扩增拟南芥螯合肽合成酶（AtPCS1）基因全序列．进一步构建AtPCS1的植物表达载体pBI121-AtPCS1，转化农杆菌EHA105；然后用转化的农杆菌EHA105以叶盘法侵染苜蓿甘农一号叶片，在50mg／LKan的筛选压下，经过约80-100d的筛选，获得57棵再生苗．随机取其中9棵再生苗进行PCR检测，其中6棵为阳性．初步鉴定表明AtPCS1基因已整合到苜蓿基因组中．     

大白菜遗传转化体系的建立

系统研究了根癌农杆菌LBA4404介导的大白菜遗传转化的若干因素,成功地建立了大白菜快速有效的遗传转化体系,并获得了大白菜抗性植株。实验结果表明,大白菜的不同基因型、苗龄、外植体类型,菌液浓度、浸染时间,共培养和抗生素浓度对转化频率均有一定影响,其最高转化频率达4.0%。抗性植株经PCR和Southern blot检测表明,目的基因已整合进大白菜基因组中。     

马尾松银松素合酶基因转化双子叶植物表达载体的构建及鉴定

以马尾松为材料,在获得马尾松银松素合酶基因的基础上,构建了该基因转化双子叶植物的表达载体,该表达载体含有35S启动子和NOS终止子,能启动基因在双子叶植物中高效地表达.设计并合成分别含有Bgl和BstE酶切位点的上下游引物,通过PCR反应扩增出含有该酶切位点的银松素合酶基因cDNA全序列,酶切后连接到pCAMBIA1301植物表达载体上.经PCR鉴定、酶切分析及DNA测序证实cDNA片段大小、序列以及读码框的正确性.最后通过电击将表达载体转化农杆菌LBA4404,为进一步研究银松素合酶基因的功能奠定基础.