人CYP2D6基因体外表达体系和功能研究方法的建立

根据GeneBank数据库中人CYP2D6基因构建表达载体pMA91-CYP2D6,转化酵母细胞AH22在体外进行表达,抽提所表达的CYP2D6微粒体蛋白进行Western Blot验证表明表达成功.该微粒体蛋白与探针药物异喹胍反应,利用HPLC检测生成产物4-羟基异喹胍,通过分析其得到酶动力学参数K m=10.14±0.94μmol/L,最终建立起完整的人CYP2D6表达体系和功能研究方法,为未来测定CYP2D6各等位基因对应酶的活性,实现临床个性化用药奠定基础.     

Src真核表达载体的构建与表达

构建酪氨酸蛋白激酶Src真核表达载体,并检测其在HEK293T细胞中的表达.根据Genebank（GI：4574718）提供的大鼠Src的cDNA序列设计特异性引物,以大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Src的目的基因,然后克隆至真核表达载体pcDNA3.1.将筛选的阳性重组子转染入HEK293T细胞系,免疫印迹检测Src的蛋白表达水平,经限制性内切酶双酶切及测序分析,扩增的Src的cDNA成功连接入pcDNA3.1,并且序列与Genebank中一致.免疫印迹结果表明,构建的Src-pcDNA3.1可在HEK293T细胞中表达.成功构建了Src-pcDNA3.1真核表达载体,并且可在HEK293T细胞中高效表达.     

GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱

为了深入研究GAS41在胚胎发育中的作用机理,应用生物信息学软件分析了斑马鱼GAS41基因的序列特征;采用RT-PCR、整体原位杂交和整体免疫组织化学方法检测其在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱.结果显示斑马鱼GAS41蛋白与人类、小鼠、大鼠同源蛋白都有91.2％的同源性,具有高度的保守性.RT-PCR结果表明GAS41在检测的成体组织中均有表达,表达丰度相当.而GAS41在胚胎受精后一直持续表达,其中受精4h后表达量升高.整体原位杂交和免疫化学结果显示GAS41特异性表达于胚胎头部,尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显.这些都提示GAS41是一个高度保守基因,在斑马鱼中枢神经系统发育过程中可能起重要作用,同时也为GAS41在胚胎发育调控中的作用机制提供实验基础.     

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗，利用Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因．利用PCR扩增HEV ORF2基因，然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichia postoris分泌型表达载体pPIC9K的a-因子信号肽编码序列3’端，重组表达载体在电击转化毕赤酵母，经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后，证实HEV ORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子．表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达，用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株，再经SDS-PAGE与Western blot证实ORF2基因在Pichia pastoris中实现了分泌表达，而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性；同时用双抗体夹心法证实在Pichia pastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体．     

小鼠Shh蛋白N端基因的克隆与原核表达

从小鼠(C57BL/6)10.5d胚胎中提取总RNA经RT-PCR扩增出编码小鼠Shh基因N端cDNA序列,克隆到大肠杆菌表达载体pQEN3构建重组表达质粒pQEN3-Shh-N.重组质粒转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol/L IPTG诱导,在SDS-PAGE上检测到20kDa目的蛋白带,与Shh N端蛋白预期大小一致,其蛋白表达量达到了全菌总蛋白的约30%.重组蛋白经Western blot鉴定结果显示,在20kDa处出现单一的显色条带,说明表达的重组蛋白为Shh N端蛋白,为研究Shh蛋白N端与毛发生长的功能奠定了基础.     

Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备

Pericardin 基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin 基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogal actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot 检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin 多克隆抗体,为Pericardin 功能的进一步研究奠定了基础.     

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.     

拟南芥锚蛋白ANK20基因表达模式

锚蛋白能介导蛋白与蛋白之间的相互作用,在细胞的生命进程中起重要的作用.对拟南芥锚蛋白基因家族成员ANK20基因的表达模式及亚细胞定位进行了研究.半定量RT-PCR结果显示,ANK20基因主要在根、叶和花组织中表达.启动子活性分析显示,GUS主要在根、叶和花中显色,与半定量PCR的结果一致.GUS结果还显示,ANK20主要在较老的根、叶缘和花茎中表达.亚细胞定位的结果表明,ANK20主要在细胞核中表达.该研究为揭示ANK20基因的功能提供了有价值的线索.     

鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备

肌球蛋白重链(MyHC)是肌肉中的主要结构和功能蛋白,在肌肉收缩过程中起关键作用.根据鳜鱼肌球蛋白重链基因中高亲水性区域DNA设计一对特异性引物,将该基因片段亚克隆到pET-32a质粒,构建重组表达载体并转化入大肠杆菌BL21中.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.8 mmol/L IPTG诱导3 h可大量表达融合蛋白.将经亲和层析纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.ELISA和免疫组化测试结果表明:此抗体有较好的特异性和抗原性.鳜鱼MyHC基因表达的研究为深入研究肌球蛋白重链的功能特性及其对肉质性状的影响奠定基础,为提高鱼类肉质提供理论基础和技术支持.     

新型蛋白酶抑制剂基因hwtx-11在大肠杆菌中的克隆表达及杀虫功能研究

将化学合成的蜘蛛毒素蛋白酶抑制剂基因hwtx-11克隆至载体pGEX4T-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.重组菌株在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的GST-HWTX-11融合蛋白的相对分子量约为33 kD.对重组菌株诱导表达后的产物进行生物活性测定,GST-HWTX-11融合蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exiguaHubner)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)在3d时的LC50分别为86.6μg/mL、119.4μg/mL;其与Cry1Ac对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫毒力也有明显的协同作用.     

E2F3基因原核表达载体的构建

为研究E2F3转录因子的结构、功能及其与肿瘤发生的联系,从人组织中克隆E2F3基因,通过巢氏PCR和桥联PCR成功构建了E2F3的原核表达载体,实现了对E2F3基因的原核表达,并用Western检测了重组蛋白。研究中发现E2F3cDNA编码序列中含有一段富含GC的区域,该区域对E2F3基因的PCR扩增影响很大。     

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的表达载体的构建及重组蛋白抗肿瘤的研究

将经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pMD18-T-LAAO和Pet28a(+)质粒的纯化回收产物进行连接,将产物Pet28a(+)-LAAO表达载体转化BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经Western-blot分析表明,重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识别.将鼻咽癌CNE-2Z、人宫颈癌LYA01021和卵巢癌A2780MSC细胞悬液接种小鼠建立小鼠实体瘤模型,分别用不同浓度重组蛋白接种荷瘤小鼠,根据瘤重和小鼠存活时间计算抑瘤率和对荷瘤小鼠生命延长率.结果表明:重组蛋白对低、中和高剂量组荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率与阴性对照组均存在极显著差异(P<0.01).本研究为开发利用竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶提供依据,为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础.     

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

果蝇nulp1特异性多克隆抗体制备及检测

为了利用果蝇模型研究nulp1蛋白在早期心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出果蝇nulp1基因的部分编码区并插入到pET28a表达载体中.之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)Rosetta( DE3);通过IPTG诱导表达His-nulpl融合蛋白,该融合蛋白采用Ni2+金属螯合层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多...     

中立型时滞系统的渐近稳定性

利用Lyapunov泛函方法，对具有离散和分布时滞的中立型系统的稳定性进行分析，得到了系统渐近稳定的两个时滞相关充分条件，这两个条件用线性矩阵不等式（LMI）表示，易于验证。最后通过一个实例验证了所得结果的有效性。     

利用蛋白质组学技术研究拟南芥隐色素突变体cry 1的差异表达蛋白

隐色素是一类蓝光受体蛋白,在动植物中调节各种光反应.在拟南芥中隐色素是核蛋白,通过蓝光调节控制下胚轴的伸长,子叶的延展,光周期诱导开花以及生物钟.拟南芥隐色1(CRY1)是一种蓝光受体,主要调节下胚轴的伸长,但CRY1下游的光化学反应仍然不清楚.拟南芥隐色素突变体cry1-304和野生型col-4在蓝光条件下,经过7 d的生长,cry1-304的下胚轴的长度比野生型col-4的下胚轴长.为了弄清楚拟南芥蓝光受体隐色素在调节植物生长发育中的机制,采用双向电泳这种蛋白质组学的方法来分离对比cry1-304和野生型col-4在蛋白水平的表达变化.选取了15个差异蛋白质点,采用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,其中10个蛋白质点得到鉴定和分析,它们包括一些普通酶、氧化还原酶、转录因子、结合蛋白、热休克蛋白等.     

甜菜M14品系特异表达基因ESTs的生物信息学分析

甜菜M14品系具有无融合生殖特性,为了获得M14品系特异表达的基因,本实验室前期利用抑制消减杂交(SSH)和mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术对M14品系和能够进行有性生殖的栽培甜菜A2Y品系进行了基因特异表达研究,获得了298条M14品系特异表达基因的ES-Ts。对这些ESTs进行生物信息学分析并进行了GO分类,筛选出5条可能与基因表达调控和细胞周期调控相关的ESTs,为进一步获得这些基因的全长序列并研究其功能奠定了基础,也为今后能在甜菜M14品系中寻找并克隆与无融合生殖相关的基因提供了可靠的保证。     

人类新基因ZNF322的研究进展

根据计算机克隆的ZNF322基因序列设计引物,从人类胚胎心脏文库中克隆了ZNF322基因.该基因位于染色体6p22.1,编码由402个氨基酸残基组成、含有9个连续排列的C2H2型锌指蛋白质.Northern杂交的结果表明该基因在成人所有被检测组织中表达。亚细胞定位研究证明ZNF322蛋白分布在胞核和胞质中.报告基因分析显示ZNF322是一种潜在的转录激活因子.