| 人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究 |
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| 引用本文： | 王晓明,王嘉榕,李燕,王玉娟.人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究[J].中国科学技术大学学报,2014(11):943-951. |
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| 作者姓名： | 王晓明 王嘉榕 李燕 王玉娟 |
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| 作者单位： | 中国科学院合肥物质科学研究院，强磁场科学中心，安徽合肥 230031 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金青年基金(31200579)资助． |
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| 摘 要： | 隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到全长1 761bp的HsCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA-HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和PCR检测获得重组质粒BacmidHsCRY1,转染昆虫Spodoptera frugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS-PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100mmol/L及200mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.31P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒-昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.
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| 关 键 词： | 人类隐花色素(CRY)蛋白 突变蛋白 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 杆状病毒-昆虫表达系统 |
Expression of HsCRY in insect cells and research into its binding state with FAD by NMR |
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| WANG Xiaoming,WANG Jiarong,LI Yan,WANG Yujuan.Expression of HsCRY in insect cells and research into its binding state with FAD by NMR[J].Journal of University of Science and Technology of China,2014(11):943-951. |
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| Authors: | WANG Xiaoming WANG Jiarong LI Yan WANG Yujuan |
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| Institution: | WANG Xiaoming;WANG Jiarong;LI Yan;WANG Yujuan;High Magnetic Field Laboratory,Hefei Institute of Physical Science,Chinese Academy of Sciences; |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Homo sapiens Cryptochrome (HsCRY) mutant flavin adenine dinucleotide (FAD) Bac-Bac baculovirus expression system |
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