| 双标记选择载体转染牛胎儿成纤维细胞方法的建立 |
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| 作者姓名： | 龚国春 戴蕴平 樊宝良 赵春江 王莉莉 王海平 郑敏 李宁 |
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| 作者单位： | 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京,100094 |
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| 基金项目： | 北京市重大科技合同项目(990411-01)和国家重点基础研究发展规划项目(G20000161)资助 |
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| 摘 要： | 以经SspI和BamHI对所构建的双标记选择载体质粒pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB双酶切后的线性目的DNA为外源基因,对电击介导的牛胎儿成纤维细胞基因转染方法的效率进行了优化.实验结果表明,当电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms时可获得约50个阳性细胞克隆/10 5 个细胞的最佳转染效率.通过牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418抗性的敏感性实验确定800μg/mL G418为快速筛选浓度,以300μg/mL G418为维持筛选浓度.从两个牛胎儿成纤维细胞系中共分离了56个绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞克隆,从中选取2个冷冻保存.经PCR检测,证实2个冷冻克隆株均含有所转染的外源基因.
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| 关 键 词： | 双标记选择载体 牛 胎儿成纤维细胞 电击 基因转染 |
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