GSNO还原酶cDNA的克隆与功能验证

目的为获得能有效下调蛋白质巯基亚硝基化修饰的功能蛋白,从大鼠皮层组织中抽提总RNA,经逆转录PCR法获得GSNOR的cDNA片段,并重组到过表达载体pShuttle-IRES-GFP中。方法利用电转染法将GSNOR过表达载体导入SH-SY5Y细胞,通过逆转录PCR及western法,验证重组载体在神经细胞系中的mRNA转录及蛋白表达效率。利用外源性一氧化氮供体GSNO处理SH-SY5Y细胞,建立硝化应激模型,通过生物素转化法检测该条件下胞内蛋白质的亚硝基化修饰水平及GSNOR的去亚硝基化修饰能力。结果成功克隆大鼠源GSNOR的cDNA,其过表达载体在神经细胞系中转录效率及蛋白表达水平均显著升高。结论生物素转化法检测结果显示,GSNOR能有效降低胞内蛋白质的整体亚硝基化修饰水平,对于Parkin、PDI、GAPDH等介导神经退行性病变关键蛋白靶点的去亚硝基化修饰作用也得到验证。