重组人过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测 |
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作者姓名: | 孙华 张自德 江仁望 王峰 |
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作者单位: | 孙华 (暨南大学药学院,广东 广州,510632); 张自德 (暨南大学药学院,广东 广州,510632); 江仁望 (暨南大学药学院,广东 广州510632 暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室,广东 广州510632); 王峰 (暨南大学药学院,广东 广州510632 暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室,广东 广州510632); |
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基金项目: | 广东省教育厅科技创新项目(项目编号:2012KJCX0017) |
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摘 要: | 为了了解人过氧化氢酶在各种常见肿瘤细胞中的表达情况,构建人过氧化氢酶的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化人过氧化氢酶,并进行活性检测.我们通过常规分子克隆手段构建原核表达载体pET-15bhCAT,将其转化大肠杆菌Rosetta-gami,经过IPTG诱导,表达产物经超声破碎后用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化,用试剂盒检测重组hCAT酶活性,然后检测其对DNA氧化损伤的保护作用.通过荧光定量PCR(qPCR)测定hCAT基因在HLF-1正常细胞与几种常见肿瘤细胞中的表达情况.本研究成功构建了pET-15b-hCAT的原核表达载体,SDSPAGE检测结果表明,IPTG诱导表达出一条分子质量约为59.7 ku的目的蛋白,该蛋白主要以可溶的形式存在,活性检测表明经纯化得到的rhCAT比活力为62.9 U/mg,pUC19质粒氧化损伤保护实验显示rhCAT对DNA有一定的损伤保护作用.qPCR检测显示hCAT基因在U937、K562、PC3、HeLa、HT-1080、HepG-2等肿瘤细胞中的表达量明显低于HLF-1正常细胞.成功构建了人过氧化氢酶的原核表达载体,利用大肠杆菌Rosetta-gami获得了hCAT的可溶性表达,纯化的rhCAT具有活性,hCAT基因在U937、K562、PC3、HeLa、HT-1080、HepG-2等肿瘤细胞中的表达量明显低于HLF-1正常细胞.这为后续功能研究及性质实验奠定了基础.
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关 键 词: | 过氧化氢酶 表达纯化 过氧化氢酶活性 DNA损伤保护 荧光定量PCR |
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