CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术，具有简单、精准等特点，已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前，通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞，获得无选择标记的基因编辑植物，该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因，采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点，采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段；采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒，将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用，体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体，采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性，可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料，在无光照条件...