肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性 |
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引用本文: | 赵德华,李季伦.肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性[J].科学通报,2004,49(15):1512-1518. |
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作者姓名: | 赵德华 李季伦 |
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作者单位: | 中国农业大学生物学院微生物系,北京,100094 |
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基金项目: | 本工作为国家重点基础发展规划(批准号:001CB108904)和国家自然科学基金(批准号:30270019)资助项目. |
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摘 要: | 通过定点突变及基因替代技术, 将肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)野生型菌株的固氮酶钼铁蛋白α亚基中铁钼辅因子(FeMoco)周围多肽链的Glnα190和Hisα194分别置换为Lys和Gln, 并构建成2个单突变株,命名为Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q. 将上述2个突变分别引入Kp-nifV突变株(与FeMoco相连接的高柠檬酸被柠檬酸置换)获得另外2个双突变株, 命名为Kp-Qα190K-nifV8722;和Kp-Hα194Q-nifV8722;. 对上述4种突变株进行诱导培养和细胞的固氮酶活性分析表明, 4种突变株都失去了固氮活性, 乙炔(C2H2)还原活性也大幅度降低, Kp-Qα190K单突变株的乙炔还原活性比Kp-Hα194Q单突变株下降得多; Kp-Qα190K-nifV8722;双突变株几乎完全丧失了活性, 而Kp-Hα194Q-nifV8722;野生型菌株10%的乙炔还原活性. 突变株将氘代乙炔(C2D2)还原成氘代乙烯(C2D2H2)的情况是: Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q-nifV8722;突变株的C2D2还原产物中, 反式-1,2-二氘代乙烯比例比Kp野生型增加了1倍, 表明固氮酶催化加氢的立体构型选择性降低. 以上结果表明, 固氮酶活性中心周围多肽环境中Glna190残基, 及与FeMoco相连的高柠檬酸, 可能直接参与质子和/或电子向活性中心FeMoco的传递. 推测Glna190和与FeMoco的Mo原子相连的高柠檬酸, 在质子和/或电子通过Mo位进入FeMoco起关键作用. 这种双突变株所产生的固氮酶, 有利于在体外研究固氮酶的催化机制, 可以通过分析用于还原底物的电子和质子进入活性中心FeMoco的位点, 推测出底物在活性中心中的络合和还原的部位.
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关 键 词: | Klebsiella pneumoniae双突变株 固氮酶活性 底物还原 |
收稿时间: | 2004-04-13 |
修稿时间: | 2004-07-02 |
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