绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

采用RT-PCR 的方法从目前最高效的纤维素酶产生菌之一的绿色木霉AS3.3711中克隆得到纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因cbh2。序列测定和分析表明，该编码序列长1416 bp，编码472个氨基酸残基，与已公布的绿色木霉CICC 13038的cbh2仅在第263位存在一个氨基酸残基的差别（Gln替换为Pro），而与里氏木霉VTT-D-80133的cbh2则完全同源。该序列已经提交GenBank，登录号为 DQ864992。利用信号肽预测软件SignalP 3.0发现该基因自身带有信号肽序列，其最大可能的切割位点在18和19位氨基酸残基之间。将该基因片段接入酿酒酵母高拷贝数整合型表达载体pScIKP中，得到重组表达质粒pScIKP-cbh2。经酶切线性化后电转化酿酒酵母AS2.489菌株，通过G418浓度梯度筛选出高抗转化子。转化子经蛋白电泳分析，发现该基因的信号肽序列能够被酿酒酵母识别，因此重组CBHⅡ成功分泌到了胞外。但可能由于酿酒酵母表达系统的过度糖基化作用，重组CBHⅡ比出发菌绿色木霉的CBHⅡ分子量要高许多，并且可能因为过度糖基化作用位点不同而形成了不同大小分子量的表达产物。转化子经CMC糖化力法测定酶活，发现该重组CBHⅡ酶活性并没有受过度糖基化作用的影响，最高可达7.71 U/mL，比大多数报道的要高。其作用的最适pH值为5.0，最适温度为65 ℃，且具有较好的热稳定性。