| 交叉酶切联合MALDI-TOF/MS分析重组蛋白二硫键分布的方法建立 |
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| 引用本文： | 徐祖敏,程锐,杨霞,杨中汉,刘少军,黎明涛,蔡卫斌,高国全.交叉酶切联合MALDI-TOF/MS分析重组蛋白二硫键分布的方法建立[J].中山大学学报(自然科学版),2011,50(5). |
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| 作者姓名： | 徐祖敏 程锐 杨霞 杨中汉 刘少军 黎明涛 蔡卫斌 高国全 |
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| 作者单位： | 1. 中山大学中山医学院生化教研室,广东广州,510080
2. 中山医学院蛋白质组学实验室,广东广州,510080 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金资助项目(30700120,30973449,81070746); “新药创制”科技重大专项基金资助项目(2009ZX09103-642); 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(3161001); 广东省自然科学基金资助项目(10151008901000007) |
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| 摘 要： | 以Kringle环为分子模型，应用MALDI-TOF/MS联合特异性蛋白酶酶切技术，探讨建立蛋白质二硫键分布和定位分析的研究方法。采用pET22b(+)原核表达体系诱导表达重组人纤溶酶原K5蛋白（rhK5），经Ni2+-NTA resin亲和层析纯化，并通过SDS PAGE和Western blot进行初步鉴定；采用MTT法分析rhK5对微血管内皮细胞的抑制活性；联合应用交叉酶切（Trypsin Gold单切或Trypsin Gold及Endoproteinase ASP N双酶切）和基质辅助激光解析-飞行时间质谱（MALDI TOF/MS）分析rhK5的二硫键分布；并应用生物信息学方法和圆二色谱法进一步验证rhK5二级结构。应用原核体系高效表达具有生物活性的rhK5蛋白，经交叉酶切联合MALDI-TOF/MS证实rhK5中的6个半胱氨酸正确配对形成了3对二硫键（Cys462:541, Cys483:524和Cys512:536），圆二色谱法测定发现rhK5为典型的β折叠型结构。上述研究结果为分析基因工程重组蛋白质中半胱氨酸配对及二硫键分布提供了方法学基础。
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| 关 键 词： | 基因工程 重组蛋白 蛋白质结构 二硫键 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 |
| 收稿时间： | 2010-12-07; |
Unraveling Disulfide-bond Distribution of Recombinant Peptide by Orthogonal Protease Digestion and MALDI-TOF/MS |
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| XU Zumin,CHENG Rui,YANG Xia,YANG Zhonghan,LIUShaojun,LI Mingtao,CAI Weibin,GAO Guoquan.Unraveling Disulfide-bond Distribution of Recombinant Peptide by Orthogonal Protease Digestion and MALDI-TOF/MS[J].Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,2011,50(5). |
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| Authors: | XU Zumin CHENG Rui YANG Xia YANG Zhonghan LIUShaojun LI Mingtao CAI Weibin GAO Guoquan |
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| Institution: | XU Zumin1,CHENG Rui1,YANG Xia1,YANG Zhonghan1,LIU Shaojun2,LI Mingtao2,CAI Weibin1,GAO Guoquan1 (1.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China,2.Proteomics Laboratory,Zhongshan Medical School,China) |
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| Abstract: | In order to establish a method for analyzing the distribution and localization of disulfide in recombinant protein by specific protease digestion combined with MALDI-TOF/MS.The pET22b(+) prokaryotic system was harnessed to generate recombinant protein of human plasminogen kingle(rhK5) which was purified by Ni2+-NTA resin affinity chromatography.SDS-PAGE and Western blot analysis were used to identify the recombinant protein.The disulfide bridging conformation and dimensional structure of rhK5 were predicted... |
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| Keywords: | genetic engineering recombinant protein protein structure disulfide bond matrix-assisted laser desorption-time of flight/ionization mass spectrometry(MALDI-TOF/MS) |
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