CRISPR/Cas9敲低环氧合酶2表达对黄曲霉毒素B1诱导肝细胞核DNA损伤与脂质蓄积的影响

为探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)诱导的肝细胞核DNA损伤与脂质蓄积的关系,以慢病毒质粒为载体,采用CRISPR/Cas9技术构建含靶向环氧合酶2(COX-2)编码基因(PTGS2)小向导RNA(sgRNA)的重组质粒,经测序验证成功后,制备假病毒感染HepG2细胞,构建稳定敲低COX-2表达的细胞.通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测mRNA和蛋白水平,结果显示与HepG2-Cas9-NC对照细胞相比,HepG2-Cas9-PTGS2敲低细胞中PTGS2 mRNA与COX-2蛋白表达水平分别减少至(49.1±1.8)%和(48.1±0.7)%.给予细胞AFB1处理,通过WB和免疫荧光(IF)法检测DNA损伤标志物γH2AX的表达水平,结果显示处理组敲低细胞中,γH2AX蛋白水平和荧光焦点形成数目显著低于对照细胞(p0.05);进一步检测脂质合成相关指标,发现敲低细胞中PPARγ蛋白、总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG)水平以及油红O染色阳性脂滴的分布密度,均显著低于对照细胞中(p0.05).在敲低细胞中回补COX-2后给予AFB1处理,γH2AX蛋白水平和脂质分布密度均显著升高(p0.05).综上,成功构建了HepG2-Cas9-PTGS2敲低细胞,并发现敲低COX-2表达对AFB1诱导的肝细胞核DNA损伤和脂质蓄积有显著抑制作用,为进一步研究靶向干预COX-2在外源化学物诱导肝细胞毒性中的作用机制提供了细胞模型和依据.