| 摘 要： | 白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)在维持小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES cells)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)体外长期培养和多能性方面具有重要作用,但在专利权的保护下,商品化的LIF始终维持较高的价格,给干细胞相关研究带来了高昂经费支出.因此,寻找商品LIF的替代品用于小鼠iPS细胞培养,将对于降低研发成本具有重要意义.本研究使用一种可分泌小鼠LIF的永生化细胞,利用其条件培养液进行iPS细胞的培养,探讨了不同稀释比对于小鼠iPS细胞体外培养及多能性的影响.将条件培养液分别稀释10倍、20倍、40倍和80倍加入培养基中培养iPS细胞,以商品化LIF作为对照组.结果显示,在不同稀释比的培养条件下,iPS细胞均可以保持典型的胚胎干细胞样克隆,且均能在稀释10倍、20倍、40倍、80倍条件下稳定传代20代以上,其中在稀释40倍条件下iPS细胞的克隆形态最好,细胞克隆较大,呈典型的隆起状,克隆周边折光较好;免疫荧光染色显示,各实验组细胞均表达多能性蛋白,Oct4、Sox2、Nanog、SSEA1.定量PCR分析显示,与在商品化LIF培养液中培养的iPS细胞相比,在40倍稀释的条件培养液内培养的细胞,在第12代的多能基因Oct4、Sox2、Nanog、AKP和CD31的表达量均显著高于对照组.此外,在10、20和80倍稀释培养条件下,Nanog的表达量高于对照,差异显著.体外分化结果显示,不同浓度LIF条件培养液和商品化LIF培养的iPS细胞均能形成类胚体,并分化为三个胚层的细胞.当将细胞注入免疫缺陷小鼠皮下,仅40倍稀释和商品化LIF培养的iPS细胞能够形成畸胎瘤,并分化为外、中、内三胚层组织.本研究优化获得了一个能够在体外长期维持iPS细胞多能性的LIF条件培养系统.
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