Biological activity and pathological implications of misfolded proteins

The physiological metabolism of proteins guarantees that different cellular compartments contain the appropriate concentration of proteins to perform their biological functions and, after a variable period of wear and tear, mediates their natural catabolism. The equilibrium between protein synthesis and catabolism ensures an effective turnover, but hereditary or acquired abnormalities of protein structure can provoke a premature loss of biological function, an accelerated catabolism and diseases caused by the loss of an irreplaceable function. In certain proteins, abnormal structure and metabolism are associated with a strong tendency to self-aggregation into a polymeric fibrillar structure, and in these cases the disease is not principally caused by the loss of an irreplaceable function but by the action of this new biological entity. Amyloid fibrils are an apparently inert, insoluble, mainly extracellular protein polymer that kills the cell without tissue necrosis but by activation of the apoptotic mechanism. We analyzed the data reported so far on the structural and functional properties of four prototypic proteins with well-known biological functions (lysozyme, transthyretin, β2-microglobulin and apolipoprotein AI) that are able to create amyloid fibrils under certain conditions, with the perspective of evaluating whether the achievement of biological function favors or inhibits the process of fibril formation. Furthermore, studying the biological functions carried out by amyloid fibrils reveals new types of protein-protein interactions in the transmission of messages to cells and may provide new ideas for effective therapeutic strategies. Received 9 November 1998; received after revision 15 January 1999; accepted 15 January 1999     

人和鸡溶菌酶结构保守性的对比研究

人体内的溶菌酶在第56位、第67位残基发生自发突变的情况下可以通过分子间的聚集形成淀粉样病变,产生一系列的临床症状甚至导致死亡.本研究基于STAMP结构比对算法,使用VMD软件主要从结构角度比较了人、鸡、狗、鼠四种脊椎动物溶菌酶的相似程度及亲缘关系,结果发现鸡的溶菌酶与人的溶菌酶结构最相似,亲缘关系最接近,并且人和鸡的溶菌酶的第56位和第67位两个残基位点在结构上高度保守.该发现为现在流行的以鸡溶菌酶为模型研究人溶菌酶引起的淀粉样病变的致病机制及治愈方法的可行性提供了必要的理论依据.     

偶氮类食品着色剂诱惑红与蛋溶菌酶的相互作用研究

采用荧光光谱、紫外吸收光谱和计算机模拟分子对接研究了偶氮类食品着色剂诱惑红与蛋溶菌酶的相互作用.讨论了诱惑红对蛋溶菌酶荧光的猝灭机理,属于静态猝灭.测定了诱惑红与蛋溶菌酶反应体系的结合常数和结合位点数,根据热力学参数焓变(ΔH>0)和熵变(ΔS>0)可推断诱惑红和蛋溶菌酶的相互作用力为典型的疏水作用力.在298、304、310 K温度下,两者间的结合常数分别为17897、19865、23267.     

巴氏毕赤酵母SMD1168表达人溶菌酶的发酵条件

研究用毕赤酵母SMD1168菌株(MutS,HIS4+)表达人溶菌酶(HLZ)的发酵条件。此菌株具有对胞外分泌的外源蛋白不降解、对反应器氧传递效率的限制不敏感的特性,有利于在常规反应器条件下的过程放大。在培养基中添加复合维生素,在流加甲醇溶液中添加山梨醇或甘露醇可维持细胞正常的生长和代谢,并表达高活性的HLZ。采用恒溶解氧的方式流加甘油溶液以提高细胞密度,在一段时间内使细胞处于碳源半饥饿状态后,使用恒速流加甲醇溶液诱导HLZ表达。HLZ的体积生成速率达到9.6mg/(L·h)左右,上清液中HLZ的含量约为1.6g/L,发酵周期为110h。     

从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质配基

为了研究噬菌体展示技术的应用，以溶菌酶为靶分子从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质的高亲和力噬菌体配体，所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达0．634．通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列，认为基元HWWW是肽段与酶分子发生亲和的必需序列．此外，由于靶分子和高亲和性展示肽的等电点分别为11．2和6．74，因此在亲和环境中携带异种电荷，利于亲和吸附的发生，而此时低亲和性展示肽与靶分子携带同种电荷，阻碍了亲和吸附．同时，高亲和性肽段HWWPAS和与其有较高同源性的肽段HWTWWNL都有适中的疏水性，这有利于肽与靶分子表面的疏水位点相互作用从而产生亲和吸附．     

利用温敏性凝胶的缓释作用促进变性溶菌酶复性

为了开发温敏凝胶在蛋白质复性方面的方法，利用N-异丙基丙烯酰胺温敏凝胶具有的缓释作用，对变性蛋白质进行了复性．考察不同合成条件下凝胶的性能，结果表明，在制胶温度为22℃、凝胶单体浓度为10％、交联度为5％制得的凝胶，具有较好的机械强度、较大的溶胀倍率、缩水倍率及良好的温敏性能．凝胶的缓释作用对变性还原溶茵酶辅助复性的影响表明，在复性酶终浓度为0．5mg／mL时，凝胶辅助蛋白质的复性收率可达68％，比直接稀释复性（收率为57％）高19％．特别是对高浓度蛋白质的复性（1．5mg／mL），凝胶辅助复性也获得了很好的效果，复性收率高出直接稀释复性37％，表现出温敏凝胶在实际蛋白质复性中的应用前景．     

人溶菌酶的双水相萃取法分离

采用双水相体系直接从重组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶,研究了体系中聚乙二醇(PEG)平均分子量,PEG、硫酸钠和氯化钠浓度,pH对人溶菌酶和总蛋白的分配系数、相体积比、萃取率和纯化因子的影响。结果表明:在PEG 4000、N a2SO4和N aC l质量分数分别为0.08、0.13、0.06,pH为5.6时,在室温下的双水相萃取率达96.63%,纯化因子为6.5。