日本赭纤虫第一类肽链释放因子C端结构域分析

eRF1的C结构域与eRF3的C结构域相互作用对于蛋白质翻译终止过程中的快速反应至关重要.通过计算机同源建模对日本赭纤虫第一类肽链释放因子C结构域Bj-eRF1C进行结构模拟,发现在Bj-eRF1C结构域中有些肽段直接参与了eRF1-eRF3相互作用,特别是Bj-eRF1C结构域中V294和D297位点高度保守.通过定点突变与pull-down分析,表明在Bj-eRF1C结构域中V294和D297是eRF1-eRF3相互作用的关键位点.     

八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区(英文)

真核生物蛋白质合成终止需要两类肽链释放因子,eRF1和eRF3.研究表明八肋游仆虫的两类肽链释放因子在体内和体外都能形成复合物,且第一类肽链释放因子eRF1a与第二类肽链释放因子eRF3的C端结合.为了确定eRF3在eRF1a上的结合区,本研究以八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a基因为模板,用PCR的方法获得了N端分别截短140和206个氨基酸的eRF1a片段,同时在这两个片段的3'端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将这两个序列分别插入原核表达载体pTWIN1,并构建重组表达质粒pTWIN1-eRF1aC1 his6和pTWIN1-eRF1 aC2his6,转入大肠杆菌BL21( DE3)中获得了可溶性表达,通过一步His60 Ni Superflow柱亲和层析,重组蛋白CBD-intein-eRF1 aC1 his6和CBD-intein-eRF1aC2 his6获得纯化.体外pull down分析显示eRF1aC1和eRF1aC2均能与八肋游仆虫第二类释放因子eRF3相互作用,这表明八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区.     

八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将八肋游仆虫第一类肽链释放因子基因eRF1a克隆入表达载体pRSETc,并在大肠杆菌Bl21(DE3)中进行诱导表达.表达形成的包含体经切胶回收,然后免疫大鼠制备抗血清.所获得的抗血清用Amersham Biosciences抗体纯化试剂盒进行纯化,SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的抗体纯度很高.Western blotting印迹和ELISA鉴定结果表明抗体特异性好,效价为1∶5000.