僧帽牡蛎碱性磷酸酶功能基团的研究

采用化学修饰法研究僧帽牡蛎碱性磷酸酶活性功能基团性质.酶经0.4mmol·L-1PCMB修饰30min后活力仍然保持不变,提示巯基与酶的活力无关;用二巯基苏糖醇(DTT)对酶进行修饰,当DTT浓度达到2.5mmol·L-1时,酶活力丧失98%,表明硫 硫键与酶活力有密切的关系;以N 溴代琥珀酰亚胺(NBS)修饰酶的色氨酸残基,酶的修饰失活呈一级反应,当NBS浓度达到0.65mmol·L-1时,酶活力丧失100%,并辅以紫外吸收光谱的变化分析,表明色氨酸残基是酶催化活力所必需的;醋酸酐、马来酸酐、甲醛等氨基试剂对酶的修饰作用显示氨基是酶的必需基团.     

耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

长毛对虾碱性磷酸酶功能基团的研究

用对－氯汞苯甲酸修饰该酶分子中的巯基，酶活力不受影响，说明该酶不是“巯基酶”．用Ｎ溴代琥珀酰亚胺修饰酶后，活力完全丧失，修饰后的酶在２７５ｎｍ处的紫外吸收峰完全消失，３４０ｎｍ处荧光发射峰也逐渐下降至完全淬灭，说明色氨酸残基是酶活性必需基因之一．用甲醛、醋酸酐修饰氨基，溴代乙酸修饰咪唑基也可以使酶活力完全丧失，说明赖氨酸残基及组氨酸残基也是酶活性功能基因．用乙酰丙酮修饰精氨酸残基，酶活力下降了５０％，精氨酸残基可能与维系酶分子构象有关．     

碱性磷酸酶在体外钙化中的作用

报道了用碱性磷酸酶抑制剂左旋咪唑和缓钙化剂偕二磷酸钠，通过体外钙化实验，跟踪测试ＡＫＰ比活力及＾４５Ｃａ在佝偻病从鼠的骺骨生长板中的掺入。结果表明，钙化与酶失活，缺乏Ｃａ＾２＋或Ｐｉ的条件下不会发生，ＡＰＫ活力对钙化的发生是必需的，ＡＫＰ尖力超高，钙化速度越快，同时，钙化会加速ＡＫＰ失活，钙化速度越快，ＡＫＰ活力降低越快。     

金黄色葡萄球菌低分子质量双特异性磷酸酶sLMWDSP的表达、纯化及性质

双特异性磷酸酶是酪氨酸磷酸酶家族中的一员,它参与生物体内信号转导、生长调控、新陈代谢等许多基本的生理活动.金黄色葡萄球菌的低分子质量双特异性磷酸酶sLMWDSP(low molecular weight dual-specificityphosphatase,Staphylococcus aureus)基因从金黄色葡萄球菌cDNA库中克隆,并在大肠杆菌中表达.高纯度的sLMWDSP用亲和层析的方法纯化得到.酶学性质研究表明:sLMWDSP催化对硝基苯磷酸(-pnitrophenyl phos-phate,pNPP)水解反应的最适pH值为6.7,最适温度为35℃,且该酶的活性不依赖于金属离子.磷酸酶通用抑制剂岗田酸(Okadaic acid)、EDTA对sLMWDSP几乎没有抑制作用,但钒酸钠能明显地抑制该酶的活性.sLMWDSP对pSer/Thr以及pTyr的寡肽均有去磷酸化作用,这说明sLMWDSP是一个新的双特异性磷酸酶.     

氨基酸对鲍鱼碱性磷酸酶活力的影响

选用L Ala、L Val、L Leu等15种氨基酸为效应物,研究它们对杂色鲍(Haliotisdiversicolor)碱性磷酸酶(EC.3.1.3.1)催化pNPP水解反应的影响.结果表明:上述这些氨基酸对鲍鱼碱性磷酸酶均有一定程度的抑制作用,抑制程度随着试剂浓度增大而加剧.当浓度为10.0mmol/L时,分别可以使酶活力下降:7.77%、36.75%、22.79%、39.86%、16.16%、19.33%、94.77%、20.19%、17.02%、40.15%、31.08%、17.52%、30.56%、36.77%和12.59%.尤其以L Cys对酶的抑制作用最为显著(抑制率为94.77%),其次是L Ile和L His,它们均能使酶活力下降40%;对酶抑制率在30%以上的氨基酸还有L Val、L Trp、L Phe和L Lys,其它选用的氨基酸对酶的抑制率小于25%.选择对杂色鲍ALP具有较明显的抑制作用的氨基酸L Val、L Ile、L Trp和L Cys等氨基酸为研究对象,研究它们对酶催化pNPP水解反应的抑制作用机理,并测定其抑制常数.结果表明L Cys的抑制作用为混合型效应,其KI和KIS值分别为0.042mmol/L和0.139mmol/L;而L Val、L Ile、L Trp为反竞争性,其KIS分别为9.56、8.55、8.09mmol/L.     

球形棕囊藻北部湾株对不同形态磷源的利用及碱性磷酸酶特性研究

【目的】探讨球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)北部湾株BBW PG-01对不同磷源利用能力的差异以及碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)特性,揭示溶解有机磷(Dissolved organic phosphorus,DOP)在该藻赤潮发生时的重要作用。【方法】在实验室培养条件下,以KH_2PO_4(PO_4~(3-))、核糖核酸(RNA)、葡萄糖-6-磷酸钠盐(G-6-P)、三磷酸腺苷二钠(ATP)和卵磷脂(LEC)作为磷源,对比研究BBW PG-01在这5种不同磷源培养条件下的生长特征及碱性磷酸酶活性(Alkaline phosphatase activity,APA),并结合磷饥饿条件下的无机磷吸收动力学及碱性磷酸酶动力学分析其对无机磷和有机磷的竞争机制。【结果】5种形态磷源均可被BBW PG-01利用,RNA为其最优生长磷源,而以大分子有机磷LEC为磷源时生长最差,两者最大细胞密度分别为4.40×10~8 cells/L和2.39×10~8 cells/L,水解大分子DOP可能需要更高的酶活性。动力学研究结果表明,在磷缺乏的条件下,BBW PG-01具有通过高亲和力来竞争磷源以维持生长的能力。【结论】球形棕囊藻北部湾株在AP的作用下,能够利用多种DOP进行生长,且在低磷条件下对无机磷(DIP)和DOP均具有较强的竞争能力,海洋中DOP可能是球形棕囊藻赤潮暴发和维持的重要磷源。     

化学振荡的间接扰动法测定磷酸苯酯

根据磷酸苯酯在碱性磷酸酶的催化作用下水解生成的苯酚对化学振荡体系(溴酸钠-硫酸-苹果酸-大环铜配合物)产生的干扰作用,首次建立一种分析测定磷酸苯酯二钠二水(DPPD)的新方法.其分析结果表明:当磷酸苯酯二钠二水的浓度在2.0×10-6~6.0×10-4mol.L-1范围内时,其浓度对数与振荡体系的振幅的改变值△A呈良好的线性关系,相关系数为0.996 49.     

Serine/threonine protein phosphatases in DNA damage response

DNA damage response (DDR) is among the most important of the mechanisms that maintain genome stability which, when destabilized, predisposes organs to cancer. Reversible phosphorylation mediated by protein kinases and protein phosphatases regulates most, if not all, cellular activities, including DDR. Protein kinase inhibitors have become the main focus of targeted therapy and anticancer drug development. However, our limited knowledge of protein phosphatase function is compromising our capacity to develop therapeutic agents against phosphatases. In this review, we summarize the roles of serine/threonine protein phosphatases involved in DDR and propose that in situ dephosphorylation of phosphoproteins by protein phosphatases, instead of proteasome-mediated degradation of phosphoproteins, is mainly employed by cells.     

HRP和AP呈现束缚-浸水应激大鼠NTS儿茶酚胺能神经元Fos表达的效果比较

用辣根过氧化物酶(HRP)单酶先后标记Fos和酪氨酸羟化酶(TH),用二氨基联苯胺(DAB)增强剂和DAB分别呈色;以及同时用碱性磷酸酶(AP)和HRP双酶分别标记TH和Fos,再分别用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)对TH和DAB对Fos呈色,比较免疫双标时两种不同酶标记显色方法...